线粒体胸苷代谢与mtDNA拷贝数变化在诱导多能性获得中的关键作用及机制

本研究针对体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）过程中线粒体DNA（mtDNA）拷贝数下降的机制展开深入探索。研究人员通过多组学分析发现，线粒体胸苷激酶2（TK2）的表达下调是导致mtDNA合成减少的关键因素，并揭示SIRT1-p53-TK2轴通过调控代谢重编程影响重编程效率。该研究为理解多能性获得与线粒体代谢的关联提供了新视角，对优化干细胞重编程技术具有重要指导意义。

　　

在生命科学领域，体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）的过程始终伴随着深刻的代谢重塑。尽管已知线粒体功能从氧化磷酸化（OXPHOS）向糖酵解转变是获得多能性的关键特征，但驱动线粒体DNA（mtDNA）拷贝数下降的分子机制仍是未解之谜。这一科学问题的破解，不仅关乎基础理论认知，更对提高临床级iPSC制备效率具有重要价值。

Konkuk大学的研究团队在《Experimental & Molecular Medicine》发表的研究中，首次系统阐明了TK2介导的线粒体胸苷代谢调控在重编程中的核心作用。通过整合RNA测序（RNA-seq）数据库的元分析、线粒体功能检测（Seahorse XF96分析仪）和染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）等技术，研究人员发现：TK2作为mtDNA合成的限速酶，其表达水平与多能性状态呈负相关；SIRT1通过去乙酰化p53抑制TK2转录，进而降低mtDNA拷贝数；意外的是，直接抑制TK2反而会损害重编程效率，提示适度的代谢转换而非完全抑制才是关键。

主要技术方法
研究采用人胚胎干细胞（hESC）系H1/H9、诱导多能干细胞（hiPSC）系CMC-hiPSC-003/009/011和成纤维细胞系（BJ1/MRC5）作为模型。通过次级重编程系统（hiF-T细胞）结合多能性标志物（SSEA4/TRA-1-60）流式分选评估重编程效率。线粒体功能通过Mito Stress Test（检测氧消耗率OCR和细胞外酸化率ECAR）量化，mtDNA拷贝数采用ND1/β-globin基因qPCR比值法测定。TK2调控机制通过SIRT1抑制剂（sirtinol）和激活剂（SRT1720）处理验证。

Downregulation of TK2 expression and mtDNA copy number is a molecular signature of human pluripotency
电子显微镜显示多能干细胞（PSC）的线粒体呈现嵴减少的球形结构，与成纤维细胞典型的管状线粒体形成鲜明对比。Seahorse检测证实PSC的OCR/ECAR比值显著降低（P<0.0001），基础呼吸和ATP产量下降5-11倍，同时mtDNA拷贝数减少约30%（图1）。这些数据确立了低TK2表达与线粒体功能幼稚化是多能性的代谢标志。

TK2 is a key regulator of mtDNA maintenance during reprogramming
元分析揭示TK2在重编程早期即显著下调（图2a-b）。hiF-T重编程模型中，TK2蛋白在30天内持续下降（图2d-e），伴随mtDNA/nDNA比值降低（图2f）和线粒体最大呼吸能力减弱（图2h）。自发分化实验反向验证：EB形成15天后TK2表达恢复，mtDNA拷贝数增加2倍（Supplementary Fig.2）。

TK2 inhibition induces mitochondrial functional changes
胸苷类似物AZT处理成纤维细胞72小时，剂量依赖性地降低TK2表达（图3a）和mtDNA拷贝数（图3b），导致OXPHOS复合体I-V蛋白普遍下调（图3c）及OCR参数恶化（图3d-e）。但过度抑制（EtBr处理）反而损害重编程（Supplementary Fig.6），提示代谢平衡的重要性。

Regulatory role of p53 and SIRT1 in TK2 expression during reprogramming
ChIP实验证实p53直接结合TK2启动子（图4b），而SIRT1通过去乙酰化p53（K382）抑制其转录活性（图4a）。sirtinol处理使重编程效率降低30%（图5a-b），同时上调p21和TK2（图5c）；反之SRT1720激活SIRT1可提升重编程效率27%（图5b），证实SIRT1-p53-TK2轴的核心调控地位。

讨论与意义
该研究首次将TK2确立为连接表观遗传调控与线粒体代谢重编程的关键节点。不同于经典Warburg效应中TK1的主导作用，多能干细胞通过SIRT1-p53轴选择性抑制TK2，实现mtDNA拷贝数的精准调控。这一发现解释了为何完全阻断TK2会激活AMPK-p53检查点（能量应激响应），反而阻碍重编程进程。研究为优化iPSC制备策略提供了新思路：适度调控而非彻底抑制TK2活性可能更有利于代谢平衡。

从转化医学视角看，TK2表达水平可能成为评估干细胞多能性和分化潜力的新型标志物。此外，TK2相关线粒体疾病（如mtDNA耗竭综合征）的细胞模型构建也可借鉴该调控机制。未来研究可进一步探索TK2与多能性网络核心因子（如OCT4/NANOG）的交叉调控，以及在不同组织来源iPSC中的代谢异质性。