从细胞废物到生物标志物：流式细胞术检测免疫细胞来源细胞外囊泡的过去、现在与未来方法解析

推荐：本文综述了流式细胞术(FCM)在检测免疫细胞来源细胞外囊泡(EVs)中的应用进展。研究人员系统梳理了EVs表面标志物(如CD9/CD63/CD81)的表型特征、检测技术(包括紫光侧向散射V-SSC和紫外激光)的革新，以及标准化流程的建立。该研究为EVs在多种疾病(如多发性硬化、类风湿关节炎)中的生物标志物开发和治疗监测提供了重要方法学支持。

　　

在生命科学领域，细胞外囊泡(EVs)正从曾经被认为是"细胞垃圾"的地位，华丽转身成为疾病诊断和治疗的新星。这些纳米级的脂质囊泡携带着母体细胞的分子特征，在多种疾病如多发性硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)和癌症中扮演重要角色。然而，由于EVs尺寸微小(30-150nm)、折射指数(RI)复杂等特点，准确检测和定量这些"细胞信使"始终是技术难题。特别是免疫细胞来源的EVs，其表面标志物的异质性表达模式更增加了检测的复杂性。

为攻克这一技术瓶颈，研究人员对流式细胞术(FCM)检测方法进行了系统性梳理。研究聚焦三大核心问题：如何通过表面标志物(如四跨膜蛋白tetraspanins)识别EVs亚型和细胞来源；如何突破传统FCM对小颗粒检测的灵敏度限制；以及如何建立标准化的检测流程。这项发表在《Journal of Pharmacological and Toxicological Methods》的研究，为EVs研究提供了重要的方法学指导。

关键技术方法包括：1)使用不同折射指数的校准微珠(如空心有机硅珠HOBs)建立粒径门控；2)应用紫光侧向散射(V-SSC)和紫外(UV)激光提高小颗粒检测灵敏度；3)采用多种EV分离技术(超速离心、尺寸排阻色谱等)；4)开发多重检测系统(如MACSPlex EV试剂盒)实现多参数分析。研究对象涵盖血浆、脑脊液等多种生物样本中的免疫细胞EVs。

【1. 引言】部分详细阐述了EVs的生物学特性。研究指出，EVs根据生物发生途径可分为外泌体(exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡小体(apoptotic bodies)，其表面标志物CD9、CD63和CD81的表达模式可能反映细胞来源。例如，CD63在脑脊液中富集，而CD81在血清中含量较低。这些发现为EVs作为疾病标志物提供了理论基础。

【2. 流式检测技术进展】部分系统回顾了技术革新历程。早期研究使用前向散射(FSC)检测血小板来源EVs，但聚苯乙烯微珠的折射指数与生物EVs存在差异。近年引入的紫光侧向散射(V-SSC)技术，通过405nm激光显著提高了80-180nm颗粒的分辨率。研究特别强调，空心有机硅珠(HOBs)因其折射指数更接近生物EVs，能更准确地反映EVs的真实粒径分布。

【3. 当前研究方法】部分总结了标准化操作流程。超速离心(dUC)和尺寸排阻色谱(SEC)是最常用的EV分离方法，分别有45%和30%的研究采用。在标志物检测方面，PE、APC和FITC是最常用的荧光染料，而MACSPlex EV试剂盒可实现39种表面标志物的同步分析。值得注意的是，约25%的研究使用Triton X-100处理来评估样本纯度。

【4. 联合分析策略】部分探讨了多技术联用方案。研究表明，将FCM与纳米颗粒追踪分析(NTA)、电子显微镜等技术结合，可互补各自优势。新兴的单颗粒干涉反射成像传感器(SP-IRIS)技术，结合了干涉测量和荧光显微技术，能检测50-200nm的EVs，为标准化检测提供了新思路。

这项研究的重要意义在于：首先，系统评估了FCM检测免疫细胞EVs的技术瓶颈和解决方案，为方法选择提供了明确指导；其次，提出的标准化流程(如使用HOBs校准、V-SSC检测等)显著提高了检测的可重复性；最后，建立的多技术联用框架，为EVs在疾病诊断和治疗中的应用铺平了道路。特别是针对神经退行性疾病和自身免疫病，该研究为开发基于EVs的液体活检技术奠定了方法学基础。

研究也指出了未来发展方向：需要进一步优化荧光标记策略，解决小颗粒信号弱的问题；建立国际统一的参考物质和检测标准；开发能同时分析EVs表面标志物和内容物的高通量平台。随着这些技术难题的逐步攻克，EVs有望成为精准医疗时代的重要生物标志物和治疗载体。