线粒体靶向型比率荧光探针在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）细胞粘度检测中的创新应用

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）早期诊断困难，亟需高灵敏度检测工具。浙江大学团队开发了一种基于FRET和分子转子机制的双通道比率荧光探针（Probe A），可特异性靶向线粒体，通过594 nm和472 nm双波长比率变化灵敏响应粘度变化，成功应用于游离脂肪酸（FFA）诱导的NAFLD细胞模型及CTRP6基因关联研究，为NAFLD早期诊断和发病机制探索提供了新策略。

　　

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为全球重大健康威胁，全球约25%人口受累。其发病与2型糖尿病（T2DM）、肥胖等代谢紊乱密切相关，但早期诊断面临两大难题：一是现有超声和血液检测灵敏度不足，多数患者确诊时已进展至晚期；二是遗传学研究匮乏，尤其补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6（CTRP6）与NAFLD的关联机制尚不明确。更关键的是，作为细胞微环境核心参数的粘度变化，在NAFLD进程中扮演重要角色，却缺乏精准监测工具。现有单波长荧光探针易受环境干扰，而传统检测方法难以实现活细胞动态观测。

针对这一系列挑战，浙江大学的研究团队在《Microchemical Journal》发表了一项突破性研究。他们创新性地设计了一种线粒体靶向的双通道比率荧光探针Probe A，通过结合荧光共振能量转移（FRET）和分子转子机制，实现了NAFLD细胞粘度的高精度动态监测。该探针采用喹啉盐-吲哚共轭体系作为分子转子和FRET受体，香豆素单元作为能量供体，在低粘度环境下因自由旋转荧光微弱，而在高粘度条件下通过抑制双键和苯胺旋转，触发472 nm和594 nm双波长比率响应。研究团队不仅验证了探针在制霉菌素诱导的粘度变化中的敏感性，更首次将其应用于CTRP6过表达的遗传相关NAFLD细胞模型，填补了该领域技术空白。

关键技术包括：1）基于FRET和分子转子的双机制探针设计；2）线粒体特异性靶向验证；3）游离脂肪酸（FFA）诱导的NAFLD细胞模型构建；4）CTRP6基因转染的遗传修饰细胞实验；5）双通道荧光成像定量分析。

分子设计
Probe A的D-π-A分子结构中，喹啉盐通过双键与吲哚共轭形成转子单元，香豆素作为刚性供体。理论计算表明，该设计使扭转能垒达4.78 kcal/mol，确保粘度响应灵敏度。

光谱特性
在甘油体系中，Probe A展现典型的粘度依赖性：当粘度从1.89 cP增至965 cP时，I₅₉₄/I₄₇₂比率值提升38倍，检测限达0.14 cP。时间分辨荧光显示供体寿命从2.58 ns降至1.45 ns，证实高效FRET（能量转移效率达86%）。

细胞应用
在HepG2细胞中，Probe A精准定位于线粒体（与MitoTracker共定位系数0.92）。FFA处理24小时后，比率值升高2.1倍，揭示脂滴积累导致的粘度增加。创新性发现CTRP6过表达使比率值进一步升高37%，首次证实该基因通过调节微环境粘度参与NAFLD进程。

结论与意义
该研究实现了三大突破：1）创建首个能同步解析CTRP6基因与NAFLD关联的荧光工具；2）开发出抗环境干扰的比率型检测方案，灵敏度较单波长探针提升近40倍；3）为NAFLD的遗传机制研究提供了新范式。特别值得注意的是，Probe A在遗传模型中的应用揭示CTRP6可能通过改变线粒体微环境粘度促进脂质沉积，这为开发靶向粘度调节的NAFLD治疗策略开辟了新途径。研究成果不仅解决了早期诊断的技术瓶颈，更为代谢性疾病的基因-微环境互作研究树立了标杆。