毛竹源有机溶剂耐受性C-糖基转移酶(PeCGT)的鉴定及全细胞催化高效合成诺托皂苷的绿色策略

本研究针对诺托皂苷(nothofagin)传统植物提取效率低、化学合成选择性差等问题，从毛竹(Phyllostachys edulis)中挖掘出具有有机溶剂耐受性的C-糖基转移酶PeCGT，通过计算模拟和定点突变鉴定G25/H26/D388三个关键残基，采用GST融合标签策略提升可溶性表达，酶学参数显示其高效催化特性(Km=99.61±0.2 μM，Kcat/Km=1.405±0.02 μM-1·s-1)。创新性构建BPupz工程菌全细胞催化体系，结合有机溶剂策略实现737 mg/L产量和95%转化率，为C-糖苷类化合物绿色制造提供新范式。

　　

研究背景与科学问题
诺托皂苷(nothofagin)作为一种具有C-C糖苷键的二氢查耳酮C-糖苷，因其独特的抗炎、抗氧化活性及在2型糖尿病治疗中的潜力备受关注。传统植物提取法受限于原料稀缺，而化学合成面临多步骤、低产率及区域选择性难题。生物催化虽具绿色优势，但核心瓶颈在于：底物根皮素(phloretin)水溶性仅20 μg/mL，且糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)循环不足。如何突破溶解性限制并开发高效C-糖基转移酶(CGT)成为产业转化的关键。

研究机构与方法
中国研究人员通过生物信息学从毛竹中挖掘出新型C-糖基转移酶PeCGT，采用同源建模和分子对接预测活性中心，通过定点突变验证功能残基；利用GST融合标签策略优化可溶性表达；构建整合纤维二糖磷酸化途径的工程菌BPupz实现全细胞催化。关键技术包括：蛋白质工程改造、酶动力学分析(K_m/K_cat测定)、有机溶剂耐受性测试、代谢通路重构等。

主要研究结果

1. PeCGT的鉴定与表征
   通过系统发育分析发现PeCGT与水稻OsCGT同源性达42%，具有典型PSPG保守结构域。酶学特性显示其对根皮素特异性催化，在30% DMSO中保持80%以上活性，体现卓越有机溶剂稳定性。

2. 关键活性位点解析
   同源建模揭示PeCGT采用GT-B折叠结构，分子对接锁定底物结合口袋。三重突变体G25A/H26A/D388A活性完全丧失，证实这三个残基通过氢键网络稳定UDPG和底物构象。

3. 全细胞催化体系构建
   工程菌BPupz整合纤维二糖磷酸化酶(CBP)和尿苷酰转移酶(UgpA)，实现UDPG原位再生。在20%乙醇-缓冲体系中，细胞膜屏障保护酶活性，最终产量达737 mg/L，较纯酶催化提升15倍。

结论与意义
该研究首次实现毛竹源PeCGT的工业化应用，其创新性体现在：(1)发现G25/H26/D388构成C-糖基化催化"三联体"，为理性设计CGT提供靶点；(2)创建"有机溶剂-全细胞"耦合系统，突破底物溶解性限制；(3)搭建纤维二糖到高值C-糖苷的一步转化平台，推动生物质资源高值化利用。发表于《Molecular Catalysis》的这项工作，为绿色制造C-糖苷类药物树立了新标杆。