综述：真菌蛋白酶在生物活性肽生产中的作用及其活性追踪的分析方法

这篇综述系统阐述了真菌蛋白酶（Fungal proteases）在生物活性肽（BPs）生产中的关键作用，归纳了当前分析技术（如FRET、ABPP、N-terminomics等）的优劣，并探讨了机器学习（ML）和基因组学在破解真菌蛋白酶特异性及优化工业应用中的潜力。

　　

真菌蛋白酶家族与生理功能

真菌蛋白酶在自然界中高度多样化，根据MEROPS数据库分类，已鉴定出108个家族，包括天冬氨酸（A1）、半胱氨酸（C19）、金属（M20）、丝氨酸（S1）和苏氨酸（T1）蛋白酶。这些酶在真菌的养分获取、应激响应和群体感应（QS）中发挥核心作用。例如，白念珠菌（Candida albicans）的Bar1蛋白酶通过切割α信息素调控种间通讯，而新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的Pqp1蛋白酶激活QS肽Qsp1，调控细胞壁功能。

生物活性肽生产与挑战

真菌蛋白酶通过固态（SSF）和液态发酵（SmF）生产，利用农业废弃物（如麦麸、豆粕）作为低成本底物。例如，米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（A. niger）的蛋白酶可水解乳蛋白释放抗氧化肽（DPPH清除率95%），或从鸭血中生成血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽（IC₅₀ 0.09 mg/mL）。然而，酶解特异性不足导致肽段异质性，苦味肽生成和底物预处理成本成为主要瓶颈。CRISPR/Cas9基因编辑和分子对接技术被探索以优化酶性能。

活性追踪技术的创新与局限

琼脂平板法通过水解圈评估活性，但受扩散效率和菌落生长干扰。改进方案如单宁酸增强对比度或荧光底物（如4-MU）可提升灵敏度。微流控液滴技术将单孢子封装于皮升级反应单元，结合荧光激活分选（FADS）实现高通量筛选，但菌丝穿透液滴膜的问题待解决。FRET探针（如Abz-KLXSSKQ-EDDnp）通过荧光信号解析酶切位点偏好性，但真菌色素会干扰光谱。纳米颗粒（如AuNPs）利用表面等离子共振（SPR）显色，但酶固定化可能降低催化效率。

计算生物学与未来方向

基因组工具（如FunGAP、Hotpep-protease）注释真菌蛋白酶基因，而AlphaFold预测结构可揭示底物结合口袋特征。机器学习模型（如DeepCleave、ProsperousPlus）通过训练已知切割位点数据集预测新靶点，但真菌特异性数据匮乏限制其泛化能力。未来需整合多组学数据构建真菌专属数据库，并开发动态活性追踪探针（如近红外ABPs）以解析原位酶动力学。

工业应用与标准化需求

尽管真菌蛋白酶在酒类澄清（减少90%浑浊蛋白）、肉类嫩化和风味增强（如咖啡吡嗪类物质）中表现优异，但缺乏标准化分析流程阻碍规模化应用。建立涵盖发酵参数、酶稳定性和肽功能评价的整合框架，将是实现精准生物制造的关键。