靶向非洲猪瘟病毒p72蛋白新型表位的单克隆抗体制备及其在诊断中的应用

为解决非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测难题，四川农业大学团队针对ASFV主要衣壳蛋白p72的N端保守区(1-224aa)展开研究，成功制备了识别新型线性表位(160ITFALKPREEYQPSGH175)的单克隆抗体2C3，并基于该抗体与兔多抗建立双抗体夹心ELISA法。该方法特异性强、灵敏度高，为ASFV诊断提供了新工具，同时丰富了p72蛋白的抗原表位图谱。

　　

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的烈性传染病，自2018年传入中国后对养猪业造成毁灭性打击。这种病毒致死率可达100%，目前尚无有效疫苗或药物，防控主要依赖早期检测。ASFV的p72蛋白作为主要衣壳蛋白，具有高度保守性和强抗原性，是诊断标志物的理想靶标。然而，现有检测方法多基于p30蛋白，针对p72蛋白的双抗体夹心ELISA检测体系尚未见报道，且p72蛋白的抗原表位图谱仍需完善。

四川农业大学的研究团队通过大肠杆菌表达系统成功制备了p72蛋白N端截短体(1-224aa)，并免疫小鼠获得单克隆抗体2C3。通过表位定位技术，首次鉴定出该抗体识别的线性表位序列₁₆₀ITFALKPREEYQPSGH₁₇₅。生物信息学分析显示该表位在25个ASFV毒株中完全保守，且位于p72蛋白三聚体表面。基于2C3与兔多抗配对，团队建立了双抗体夹心ELISA法，验证显示该方法可特异性识别ASFV，灵敏度显著优于传统方法。

关键技术包括：1）p72-N重组蛋白的原核表达与纯化；2）杂交瘤技术制备单克隆抗体；3）肽扫描法进行表位定位；4）结构模拟分析表位空间位置；5）双抗体夹心ELISA体系优化与验证。

抗原制备
研究团队构建pET-28a(+)-p72-N重组质粒，经IPTG诱导获得27 kDa的包涵体蛋白，镍柱纯化后验证其与ASFV阳性血清的良好反应原性。

单抗制备与表位鉴定
通过杂交瘤技术获得2C3单抗，肽扫描确定其识别表位为₁₆₀ITFALKPREEYQPSGH₁₇₅。序列比对证实该表位在25株ASFV中100%保守，三维结构显示其位于p72三聚体表面暴露区域。

检测方法建立
以2C3为捕获抗体、兔多抗为检测抗体，建立的双抗体夹心ELISA对ASFV阳性样本检出限达1:1280稀释度，与PCV2、PRRSV等常见猪病病原无交叉反应。

讨论与意义
该研究首次报道了p72蛋白的线性表位₁₆₀ITFALKPREEYQPSGH₁₇₅，其高度保守性确保检测方法的广谱性。建立的双抗体夹心ELISA填补了p72蛋白诊断技术的空白，为ASFV现场筛查提供了简便可靠的工具。表位信息的揭示还为亚单位疫苗设计提供了新靶点。论文成果发表于《Veterinary Microbiology》，对ASF防控具有重要实践价值。

研究团队特别指出，该方法可与其他靶标（如p30、CD2v）的检测体系联用，形成ASFV诊断"组合拳"。未来将进一步开展田间试验验证，并探索该表位在疫苗研发中的应用潜力。