基于NanoBiT分裂荧光素酶系统的HiBiT标记猪德尔塔冠状病毒构建及其在抗病毒研究中的应用价值

本研究针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)缺乏高效检测工具的问题，通过酵母转化相关重组(TAR)技术构建HiBiT标记的重组病毒。研究发现该标记系统较传统eGFP具有更高信号强度(峰值提升3倍)和稳定性(连续传代5代无衰减)，为抗PDCoV药物筛选提供了灵敏平台。该成果发表于《Veterinary Microbiology》，为冠状病毒跨种传播机制研究奠定技术基础。

　　

在冠状病毒家族中，猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)因其独特的跨宿主传播能力引发关注。这种直径约120纳米的RNA病毒不仅能导致仔猪致命性腹泻，更令人担忧的是其实验室证实可感染人类肠道细胞。然而当前PDCoV研究面临两大技术瓶颈：传统荧光报告病毒信号弱(eGFP标记仅能检测到10³ TCID₅₀/mL)，且基因组操作困难(25.4kb的RNA易断裂)。四川大学的研究团队在《Veterinary Microbiology》发表突破性成果，通过创新性技术路线解决了这些难题。

研究采用酵母转化相关重组(TAR)技术构建PDCoV全长感染性克隆，相比传统细菌人工染色体(BAC)方法，该技术将构建周期从3周缩短至5天。关键实验技术包括：1)基于同源重组的TAR克隆系统组装病毒基因组；2)NS6基因位点插入11个氨基酸的HiBiT标签；3)建立稳定表达LgBiT大亚基的ST细胞系；4)使用双荧光报告系统(eGFP与HiBiT)平行验证。

【Construction of the PDCoV Infectious Clone】
通过设计5个重叠片段(F1-F5)成功组装野生型PDCoV基因组，测序显示克隆保真度达99.98%。值得注意的是，在酵母系统中直接引入eGFP导致病毒滴度下降10倍，而HiBiT标记病毒维持了原始毒力(TCID₅₀ 10^6.5/mL)。

【Functionality Validation of HiBiT Reporter】
在抗病毒药物筛选中，HiBiT系统展现出显著优势：检测糖基化抑制剂衣霉素(tunicamycin)时信噪比达28:1，远超eGFP的5:1。动态监测显示，HiBiT信号在感染后12小时即可检出，比细胞病变效应(CPE)观察提前24小时。

【Disscussion】
该研究创新性地将NanoBiT技术应用于冠状病毒系统，其11个氨基酸的HiBiT标签仅为传统荧光蛋白的1/70大小。特别值得注意的是，构建的LgBiT-ST细胞系实现了活细胞实时监测，解决了传统荧光素酶检测需裂解细胞的技术瓶颈。在机制研究方面，NS6蛋白C端标签的精准定位为冠状病毒辅助蛋白功能研究提供了新范式。

这项研究不仅建立了目前最灵敏的PDCoV检测平台(检测限达10¹ TCID₅₀/mL)，更开创性地证明微型标签技术在大型RNA病毒中的应用可行性。技术路线可拓展至SARS-CoV-2等其它冠状病毒，为未来新发病毒研究提供了通用型工具开发框架。