基于光谱流式细胞术的免疫细胞深度代谢谱分析：一种全面验证方法

本研究针对免疫代谢研究中单细胞代谢分析工具成本高、标准化不足的瓶颈问题，开发了基于商业抗体的光谱流式细胞术代谢检测方案。研究人员通过12种免疫标记与9种代谢靶标（涵盖糖酵解、TCA循环、ETC等8条通路）的组合，结合NAD(P)H自发荧光技术，成功解析了肺疫苗接种后巨噬细胞与T细胞的代谢重编程特征。该研究为免疫代谢研究提供了标准化、低成本的技术方案，对理解免疫细胞功能调控机制具有重要意义。

　　

免疫细胞的功能与其代谢状态密切相关，但现有技术难以在单细胞水平同时解析免疫表型和代谢特征。传统代谢分析方法如Seahorse细胞能量代谢分析仪需要大量同质细胞，而单细胞RNA测序仅能反映基因表达水平。更棘手的是，现有流式细胞术代谢检测方案依赖昂贵的定制抗体，且缺乏标准化的验证方法。这些技术瓶颈严重限制了免疫代谢研究的广度和深度。

悉尼大学的研究团队在《iScience》发表的研究中，开发了一种创新的光谱流式细胞术代谢检测方案。该方案整合12种免疫表型标记和9种代谢通路关键蛋白（包括GAPDH、IDH2、细胞色素c等），全部采用商业可得抗体，同时利用NAD(P)H自发荧光实现糖酵解活性的无标记检测。通过系统验证，研究人员成功应用于肺腺病毒CD40L疫苗接种模型，揭示了不同免疫细胞亚群的特异性代谢程序。

关键技术方法包括：1）光谱流式细胞术多参数检测（5激光64检测器系统）；2）代谢通路特异性抑制剂验证（如2-DG抑制糖酵解、etomoxir抑制脂肪酸氧化）；3）NAD/NADH酶学检测；4）小鼠肺疫苗接种模型（MemVax腺病毒载体）；5）组织驻留与循环细胞的体内标记（CD45-biotin静脉注射）。

验证新型代谢检测方案通过经典免疫细胞激活模型
研究人员首先在M1/M2型巨噬细胞和CD8⁺ T细胞激活模型中验证检测方案。M1巨噬细胞显示糖酵解标志物GAPDH和HIF-1α信号上调，而M2型则高表达氧化磷酸化标志物IDH2、细胞色素c和脂肪酸氧化酶CPT1A。CD8⁺ T细胞激活后呈现典型的"糖酵解-OXPHOS"双上调模式，早期（4小时）依赖脂肪酸氧化，后期（24小时）转向糖酵解和氨基酸代谢。

中心碳代谢相关靶标的验证
通过代谢抑制剂处理证实：2-DG处理显著降低GAPDH表达；低氧条件（3% O₂）联合DMOG处理增加HIF-1α表达；寡霉素处理降低IDH2和细胞色素c表达。这些结果证实所选标志物能准确反映对应通路活性。

脂肪酸和氨基酸代谢靶标的验证
研究发现：棕榈酸培养条件下，etomoxir特异性降低CPT1A表达；脂肪酸合成抑制剂C75剂量依赖性降低ACAC表达。氨基酸剥夺实验显示CD98表达与氨基酸利用率正相关，而iNOS表达在LPS/IFN-γ刺激后显著升高且可被2-DG抑制，证实其与糖酵解的关联。

疫苗接种诱导肺髓系细胞亚群的独特代谢特征
应用该方案分析CD40L疫苗接种后肺组织发现：肺泡巨噬细胞（AM）呈现典型的M2样代谢特征（高OXPHOS和脂肪酸代谢）；间质巨噬细胞（IM）表现中间表型；而单核细胞则呈现M1样糖酵解表型。LPS再刺激显示疫苗接种组髓系细胞表现出"训练免疫"特征，MHC-II表达显著增强。

CD8⁺ T细胞亚群在疫苗接种后显示特征性代谢表型
组织驻留记忆T细胞（T_RM）高表达细胞色素c和CPT1A，依赖脂肪酸氧化；效应/记忆T细胞（T_eff/T_EM）上调GAPDH偏向糖酵解；而循环中的初始T细胞（CD62L⁺CD44^-）以OXPHOS为主。这种代谢异质性反映了不同T细胞亚群的功能需求。

光谱流式细胞术检测的单细胞自发荧光与糖酵解状态相关
研究发现M1刺激显著增加NAD(P)H自发荧光（UV5通道检测），与GAPDH表达正相关（R²=0.82）。2-DG处理降低该信号，证实其作为糖酵解活性无标记检测指标的可靠性。

这项研究建立了首个全面验证的光谱流式细胞术代谢检测方案，解决了免疫代谢研究的重大技术瓶颈。其创新性体现在：1）全部采用商业抗体，大幅降低成本；2）系统验证确保数据可靠性；3）整合自发荧光检测拓展应用范围；4）成功应用于复杂组织微环境分析。研究不仅揭示了肺免疫应答中代谢重编程的细胞特异性规律，更重要的是提供了一套标准化研究工具，将推动免疫代谢领域的发展。该技术方案特别适用于研究感染、肿瘤和自身免疫性疾病中的免疫代谢调控机制，为开发靶向代谢的免疫干预策略奠定基础。