GSK3β磷酸化调控tau蛋白相分离：靶向PRD结构域抑制tau聚集的神经退行性疾病治疗新策略

tau蛋白异常聚集是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的重要病理特征。本研究通过光遗传学工具（optoDroplets）结合细胞生物学技术，揭示tau蛋白富含脯氨酸结构域（PRD）的GSK3β依赖性磷酸化驱动其相分离（phase separation）的分子机制，发现小分子化合物44可通过抑制GSK3β活性减缓tau病理聚集，为神经退行性疾病治疗提供新靶点。

　　

神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）的核心病理特征是tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结（NFTs）。近年研究发现，生物大分子通过液-液相分离（LLPS）形成无膜细胞器是生理调控的重要机制，而异常相分离可能导致tau蛋白从液态向固态转变，最终形成病理性聚集体。然而，tau蛋白相分离的具体分子机制及其在疾病中的作用尚不明确，尤其是各结构域的功能差异和翻译后修饰的调控机制亟待阐明。更关键的是，基于相分离原理的药物干预能否成为治疗新策略仍属未知。

澳门大学的研究团队在《Biomedicine》发表的研究中，创新性地结合光遗传学工具optoDroplets与药理学方法，系统解析了tau蛋白相分离的调控机制。研究首先通过构建光控tau蛋白（Opto-tau）模型，结合微管解聚剂nocodazole处理，模拟tau从生理性相分离到病理性聚集的动态过程；利用免疫荧光染色、荧光漂白恢复（FRAP）等技术分析不同结构域突变体的相分离特性；通过磷酸化位点突变和GSK3β抑制剂处理，阐明PRD结构域关键磷酸化位点的调控作用；最后在3xTg-AD小鼠模型中验证候选化合物44的治疗效果。

研究结果部分：

1. 光控tau模型揭示P301L突变损害相分离可逆性
   通过构建CryOlig-mCherry-tau光遗传系统，发现P301L突变使tau-微管共凝聚体失去液态流动性，FRAP实验显示其恢复速率显著低于野生型，提示该突变促进液-固相转变。

2. PRD结构域是tau相分离的驱动核心
   结构域缺失实验表明，PRD（富含脯氨酸结构域）与R1-R4（微管结合重复区）协同驱动相分离，而N端起抑制作用。在nocodazole处理的细胞中，缺失PRD的tau完全丧失相分离能力。

3. T231/S235/S237磷酸化加速病理相分离
   PRD-R4结构域的磷酸化模拟突变体（T231D/S235D/S237D）相分离效率显著高于磷酸化缺陷型（T231A/S235A/S237A），且GSK3β抑制剂SB216763和LiCl能特异性抑制野生型而非突变体的相分离。

4. 磷酸化调控tau在核斑点中的定位
   内源性磷酸化tau（p-tau T231）与核斑点标志物SC-35共定位，PRD-R4-T231A突变显著减少tau在核斑点的滞留，而P301L突变则使核斑点凝聚体流动性降低，提示病理相分离可能破坏核RNA剪接功能。

5. 多靶点化合物44展现治疗潜力
   该化合物通过增强GSK3β S9位点磷酸化抑制其活性，降低tau磷酸化水平。在3xTg-AD模型中，化合物44处理显著改善小鼠认知功能（Morris水迷宫测试），并减少脑内tau聚集体（硫磺素S染色）。

这项研究首次系统阐明了tau蛋白不同结构域在相分离中的"刹车"（N端）与"驱动"（PRD-R1-R4）作用，提出GSK3β介导的PRD磷酸化是调控tau相分离的关键开关。更重要的是，研究不仅为神经退行性疾病的病理机制提供了新视角——即异常相分离可能导致核斑点等无膜细胞器功能障碍，还通过多靶点药物设计策略，验证了靶向GSK3β-tau磷酸化轴的治疗可行性。化合物44作为同时靶向Aβ、胆碱酯酶和GSK3β的三重抑制剂，其独特的作用机制为开发下一代抗AD药物提供了重要模板。这些发现对理解tau蛋白从生理性液滴到病理性聚集体的转变过程具有里程碑意义，也为基于相分离调控的神经退行性疾病治疗开辟了新途径。