三阴性乳腺癌MDA-MB-231-luc-GFP细胞系的基因组内异质性：揭示实验可重复性的潜在挑战

本研究针对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB-231-luc-GFP在长期培养中产生的基因组异质性(ILH)问题，通过全外显子测序和拷贝数变异(CNAs)分析，发现不同来源和传代次数的亚系存在显著SNVs和CNAs差异。研究首次提出"系内异质性"(ILH)概念，证实基因组不稳定性会导致实验结果偏差，强调细胞传代特异性基因组特征对癌症研究可靠性的重要意义。

　　

研究背景与意义
在癌症研究领域，细胞系作为肿瘤生物学研究的经典模型，其基因组稳定性直接影响实验结果的可靠性。然而，三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB-231-luc-GFP在长期培养过程中表现出的基因组演化现象长期被忽视，这可能导致不同实验室甚至同一实验室不同时期的实验结果出现难以解释的差异。更令人担忧的是，主流癌症细胞资源库如CCLE和COSMIC往往不记录培养传代过程中获得的基因组变化，使得研究人员可能将传代特异性突变误认为新发突变。

研究设计与方法
西班牙研究团队对三个商业来源的MDA-MB-231-luc-GFP亚系(CL0、CL1、CL2)及CL1的五个传代样本(E01-E06)进行了系统研究。采用全外显子测序(1000X深度)和基于Sequenza的拷贝数分析，以健康人真皮成纤维细胞(HDF)作为对照。通过Jaccard系数评估SNVs相似性，CNVMetrics分析CNAs差异，并运用SigProfiler进行突变特征解析。

主要研究结果

3.1 核型分析确认近三倍体特征
DAPI显带技术揭示CL1亚系平均染色体数为62.12(范围57-87)，存在双微染色体，与ATCC报告的模式数64相符，证实该细胞系保持近三倍体特性。

3.2 亚系间显著的拷贝数异质性
全基因组CNAs分析显示：所有亚系共同获得1q和8q染色体区域，但CL0独有8p部分缺失。关键驱动基因呈现差异：NOTCH1、TP53等在所有亚系均获得3拷贝，而CL0特有PIK3CA、TBX3等高拷贝数变异(≥5)。

3.3 SNVs揭示的基因组差异
在26,173个SNVs中，CL0亚系携带192个独有突变。特别值得注意的是，BRAF-G464V和KRAS-G13D这两个已验证的致癌突变在CL0中呈现更高变异等位基因频率(VAF>0.5)。

3.4 BRCA驱动基因非同义SNVs的VAF变异
38个BRCA驱动基因中共发现78个非同义SNVs。CL0在AKAP9、BRAF等基因的7个SNVs呈现VAF显著升高，其中CDKN1B-V109G在转移性乳腺癌中有临床相关性报道。

3.5 亚系特异性突变特征
所有亚系均显示SBS1/SBS5时钟样特征，但最老的CL0亚系独有紫外线相关特征SBS7a/DBS1，提示可能存在特殊的环境暴露史。

3.6 基因组相似性分析
SNVs相似性高达0.98(Jaccard系数)，但CNAs相似性仅0.3-0.4，CL0表现出最显著的基因组偏离，特别是CL1.E03和CL1.E06与CL2聚为一类。

研究结论与讨论
该研究首次提出"系内异质性"(ILH)概念，系统揭示了MDA-MB-231-luc-GFP细胞系在长期培养中产生的基因组多样性。特别值得关注的是：

1. 技术层面：在缺乏匹配正常样本的情况下，基于log₂深度比的CNAs分析仍能有效捕捉亚系间显著差异，但需注意可能的噪声干扰。

2. 生物学意义：CL0亚系特有的高VAF致癌突变(如KRAS-G13D)可能增强转移潜能，这解释了为何早期购买的细胞系常表现出更强的侵袭表型。

3. 临床相关性：新发现的SPEN-R2283K突变及CDKN1B-V109G等变异可能成为TNBC治疗的新靶点，但需进一步功能验证。

4. 方法论启示：研究强调在实验设计中必须记录细胞系的具体传代历史，建议关键实验使用多批次细胞系平行验证。

该成果发表于《Computational and Structural Biotechnology Journal》，为癌症细胞系研究建立了基因组稳定性评估的新标准，对提高临床前研究的可重复性具有重要指导价值。研究同时提示，商业来源的基因修饰细胞系可能存在未声明的基因组差异，这为细胞培养质量控制提出了新的挑战。