基于CRISPR-Cas12技术的免RNA提取SARS-CoV-2检测方法在病毒转运培养基与干拭子中的比较研究

本研究针对COVID-19检测中RNA提取步骤耗时耗成本的问题，开发了基于CRISPR-Cas12的免提取检测方案。通过比较病毒转运培养基(VTM)与干拭子样本的检测效率，发现干拭子样本的CRISPR检测与RT-PCR结果100%一致，为简化呼吸道病原体检测流程提供了新策略。

　　

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的COVID-19大流行暴露了全球诊断体系的瓶颈。尽管逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)仍是金标准，但其依赖繁琐的RNA提取步骤，导致检测成本高、耗时长。在此背景下，具有"基因剪刀"之称的CRISPR-Cas系统因其高特异性和常温反应特性，成为诊断技术革新的突破口。特别是Cas12蛋白的"附带切割"特性，能在识别靶序列后非特异性切割荧光报告分子，实现信号放大。然而，现有CRISPR检测多需提取纯化步骤，且对不同样本类型的适应性缺乏系统评估。

来自巴巴原子研究中心医院的研究团队在《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》发表的研究，首次系统比较了两种印度商业病毒转运培养基(Trueprep AUTO和HiViral)与干拭子样本在免RNA提取条件下的CRISPR-Cas12检测性能。研究采用蛋白酶K裂解结合热处理的样本前处理方法，通过逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)预扩增，再利用Cas12-crRNA复合物进行特异性检测。样本来源于COVID-19阳性患者的鼻咽/口咽拭子，部分通过Truenat系统进行RT-PCR验证。

主要技术方法
研究采用三步法：1) 样本前处理：VTM/干拭子经蛋白酶K消化和95℃热裂解释放核酸；2) 等温扩增：使用RT-LAMP扩增病毒ORF1ab和E基因；3) CRISPR检测：Cas12-crRNA复合物识别靶序列后切割荧光报告分子。对比样本包括Molbio Diagnostics的Trueprep AUTO VTM和HiMedia的HiViral VTM及配套干拭子，以RT-PCR的Ct值为金标准。

Sample collection
研究纳入的Trueprep AUTO VTM样本来自医院常规检测剩余标本，而HiMedia样本同时包含VTM和对应干拭子。所有样本均通过Truenat系统进行ORF1/E基因双重RT-PCR验证，确保病毒载量已知。

CRISPR-Cas12检测性能
在Trueprep AUTO VTM样本中，CRISPR检测灵敏度显著受抑制，仅能检出Ct值<25的高病毒载量样本。而HiViral VTM表现稍好，但仍有假阴性。令人惊讶的是，干拭子样本展现出100%检测一致性，即使Ct值达30的样本仍可检出，提示VTM中的某些成分可能抑制CRISPR反应。

Discussion
研究发现不同商业VTM对CRISPR检测存在差异抑制，可能与缓冲液成分有关。干拭子检测的优势在于避免了VTM的干扰，且省去离心步骤。该工作流程可扩展至其他呼吸道病原体检测，为资源有限地区提供更经济的解决方案。作者特别指出，这是首个系统评估干拭子直接用于CRISPR检测的研究，为开发"样本进-结果出"的床边检测设备奠定基础。

研究意义
这项研究突破性地证明：1) 干拭子可作为CRISPR检测的理想样本，避免VTM抑制；2) 建立的标准操作流程(SOP)适用于不同商业产品评估；3) 为开发整合样本处理、扩增和检测的微型化设备提供理论依据。尽管仍需优化反应体系以提高对VTM样本的兼容性，但该技术显著缩短检测时间至1小时内，成本降低约60%，对疫情防控具有重要实践价值。