两种酰化花青素标准物质的研制及其在质量控制中的应用

为解决天然花青素定量分析缺乏标准物质的难题，中国农业科学院团队成功研制出两种酰化花青素标准物质（CRMs）——Cy3(sin)diG5G三氟乙酸盐和Cy3(p-cum)diG5G三氟乙酸盐。通过质量平衡法（MB）与定量核磁共振（qNMR）联用技术确定其纯度分别为92.9%±0.4%和94.7%±0.3%（k=2），并验证了材料在4℃和?20℃下的稳定性。该研究为天然色素产品质量控制提供了关键标准参照，填补了酰化花青素标准物质领域的空白。

　　

在食品与健康领域，花青素作为天然水溶性色素因其抗氧化、抗炎等生物活性备受关注。然而，当前研究面临两大瓶颈：一是常用pH示差法等检测技术无法区分结构相似的酰化与非酰化花青素，导致定量误差；二是高稳定性、高活性的酰化花青素缺乏单体标准物质，制约了其功效研究。据统计，全球市场上90%的花青素标准品仅为非认证参考物质（RMs），且尚无酰化花青素认证标准物质（CRMs）的报道。这种标准缺失使得行业面临质量控制混乱、科研数据可比性差等问题，直接影响功能食品和药品的开发。

针对这一挑战，中国农业科学院的研究团队从红甘蓝中分离纯化出两种新型酰化花青素单体：氰定-3-O-(2-O-葡萄糖基,6-O-芥子酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷三氟乙酸盐（Cy3(sin)diG5G trifluoroacetate）和氰定-3-O-(2-O-葡萄糖基,6-O-对香豆酰)葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷三氟乙酸盐（Cy3(p-cum)diG5G trifluoroacetate）。研究采用柱层析纯化结合HPLC-DAD/LC-MS结构鉴定技术，创新性地运用质量平衡法（MB）与定量核磁共振（qNMR）双系统交叉验证策略，攻克了花青素易降解导致的纯度测定难题。实验证实两种标准物质在4℃和?20℃条件下可稳定保存12个月以上，其认证纯度值的不确定度均低于0.5%（k=2）。该成果发表于《Food Chemistry》，标志着酰化花青素标准化研究取得突破性进展。

关键技术包括：1）采用制备型高效液相色谱（prep-HPLC）进行克级规模单体分离；2）通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）和二维核磁共振（2D-NMR）解析复杂酰化结构；3）建立基于钾氢邻苯二甲酸盐内标物的qNMR绝对定量方法；4）设计温度梯度实验（-20℃至60℃）评估材料稳定性。

化学试剂与仪器
研究使用Dikma Technologies提供的色谱纯溶剂，以GBW 06149标准物质（纯度99.983%±0.024%）作为qNMR定量的基准参照。

HPLC分析
全波长扫描显示两种候选CRMs无显著杂质峰（图1）。通过优化流动相比例（甲醇-0.1%甲酸水溶液）和色谱柱类型（C₁₈与HILIC），建立了特异性分离方法，确认主峰面积占比均>99%。

结论
该研究首次实现酰化花青素CRMs的标准化制备，其创新性体现在三方面：1）建立"MB+qNMR"双轨制纯度认证体系，解决发色团干扰传统检测的难题；2）揭示酰化基团（芥子酰/对香豆酰）通过增强分子平面性提升稳定性的机制；3）开发的CRMs已成功应用于紫薯、黑米等农产品中花青素异构体的准确定量。

讨论
相较于传统非酰化花青素标准品，本研究开发的CRMs具有三大应用优势：1）三氟乙酸盐形态显著改善水溶性和冻干稳定性；2）扩展不确定度（<0.5%）满足ISO Guide 35对一级标准物质的要求；3）为欧盟No 1129/2011法规中规定的花青素添加剂限量检测提供技术支撑。作者团队指出，下一步将开展CRMs在跨实验室验证研究，并开发更多元化的酰化花青素标准品系列。

作者贡献
通讯作者Zhenzhen Xu（徐珍珍）研究员负责研究设计与基金支持（国家自然科学基金32222067）；第一作者Guowen Li（李国文）完成主要实验与论文撰写；Xiaojun Liao（廖小军）教授参与质控体系构建。所有作者声明无利益冲突。该工作获得中国农科院科技创新工程（CAAS-ASTIP-IQSTAP-2025）资助。