基于CHO系统表达犬瘟病毒H蛋白构象表位的阻断ELISA法及中和抗体评价新策略

本研究针对犬瘟病毒(CDV)疫苗免疫后中和抗体检测的瓶颈问题，开发了基于CHO细胞表达CDV-H蛋白的阻断ELISA方法。研究人员通过杂交瘤技术获得识别构象表位的中和单抗，结合分子对接鉴定出9个关键抗原识别位点(120Q/123N/126N等)，证实其在不同基因型CDV毒株中的高度保守性。所建立的阻断ELISA与病毒中和试验(VNT)显著正相关(R2=0.6905)，为疫苗免疫效果评估提供了高效替代方案，同时为CDV诊断试剂和新型疫苗设计提供了关键表位数据。

　　

犬瘟热作为由犬瘟病毒(CDV)引起的烈性传染病，每年给全球宠物养殖业和濒危物种保护造成数十亿美元损失。尽管疫苗接种是主要防控手段，但传统病毒中和试验(VNT)需要活病毒操作且耗时3-5天，而常规ELISA又无法区分中和抗体与非保护性抗体。更棘手的是，CDV-H蛋白作为主要中和靶点存在抗原漂移现象，其关键表位信息不清导致疫苗设计缺乏理论依据。

针对这些难题，华中农业大学的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表的研究中，创新性地采用CHO真核表达系统获得正确糖基化修饰的CDV-H蛋白，通过杂交瘤技术筛选出能识别构象表位的中和单抗。运用分子对接和分子动力学模拟，首次精确定位了120Q、123N、126N等9个关键抗原识别位点，进化树分析证实这些位点在所有CDV基因型中高度保守。基于该单抗建立的阻断ELISA法，与VNT结果呈现显著相关性（分组后R²=0.9272），可在2小时内完成中和抗体检测。

关键技术包括：1）CHO细胞表达系统制备CDV-H蛋白；2）杂交瘤技术筛选中和单抗；3）分子对接与分子动力学模拟鉴定表位；4）使用实验室保存的America-1/Asia-1/Asia-4基因型毒株验证交叉反应性；5）建立基于单抗竞争原理的阻断ELISA。

【细胞、病毒、抗体和血清样本】
研究采用Vero-SLAM细胞培养不同基因型CDV毒株，通过SDS-PAGE和WB验证CHO系统表达的62 kDa CDV-H蛋白具有良好的免疫反应性，能被阳性犬血清特异性识别。

【重组CDV-H蛋白表达纯化与免疫反应性分析】
纯化的CDV-H蛋白成功免疫小鼠获得单抗，间接ELISA显示抗体效价达1:51200，免疫荧光证实其能识别天然病毒颗粒上的构象表位。

【讨论与结论】
该研究不仅解析了CDV-H蛋白的关键中和表位空间构象，更创新性地将构象表位识别与免疫效果评价相结合。所开发的阻断ELISA可实现：1）替代VNT进行大规模疫苗免疫效果监测；2）为多宿主交叉保护疫苗设计提供表位参考；3）推动CDV诊断试剂升级换代。特别值得注意的是，鉴定出的9个氨基酸位点在雪貂、狐狸等易感动物对应的CDV毒株中同样保守，这为开发广谱疫苗奠定了分子基础。

研究团队强调，该方法已成功应用于犬只免疫效果评估，未来可进一步拓展至毛皮动物养殖场的疫苗免疫监测。该成果不仅解决了CDV防控中的关键技术瓶颈，其"构象表位-中和抗体-阻断检测"三位一体的研究思路，也为其他病毒性疾病的抗体检测提供了范式参考。