基于UV诱变与人工荧光标记的高通量筛选技术提升出芽短梗霉β-葡聚糖产量的研究

本研究针对出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）β-葡聚糖（β-glucan）产量低、缺乏高效筛选方法的问题，开发了一种结合UV诱变与特异性荧光标记（CBM4-双分子荧光互补系统）的高通量筛选技术。通过流式细胞术筛选突变株并经高葡萄糖驯化，最终获得产量提升65.18%（达4.84 g/L）的菌株D7，分子量从7500 kDa降至5500 kDa，为微生物源β-葡聚糖的工业化生产提供了新策略。

　　

β-葡聚糖（β-glucan）作为一种具有免疫调节、抗肿瘤活性的天然多糖，在医药和食品领域备受关注。然而，从植物中提取效率低下，而微生物发酵生产又面临产量低、杂质多等瓶颈。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）虽能合成β-1,3/1,6-葡聚糖，但其产量通常不足3 g/L，且传统筛选方法效率低下。如何快速获得高产菌株，成为突破产业化壁垒的关键。

山东省科学院的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表的研究中，创新性地将UV诱变与人工荧光标记技术结合。他们首先利用碳水化合物结合模块CBM4对β-1,3-葡聚糖的特异性识别能力，构建了双分子荧光互补系统（BiFC），使β-葡聚糖与荧光蛋白结合后发出信号。通过流式细胞术快速分选高荧光强度的突变株，再经高葡萄糖浓度驯化提升菌株适应性。最终，菌株D7的β-葡聚糖产量从原始菌株M3的2.93 g/L提升至4.84 g/L，分子量从约7500 kDa降至5500 kDa，表明该方法不仅能提高产量，还可调控产物分子特性。

关键技术方法
研究采用UV诱变构建随机突变库，利用CBM4-BiFC荧光探针标记β-葡聚糖，通过流式细胞术分选高荧光信号菌株，并结合高葡萄糖培养基驯化提升菌株性能。所有实验菌株来源于实验室保藏的A. pullulans M3（ATCC 15233）。

研究结果

1. 荧光系统优化：确定CBM4与底物反应2小时为最佳检测窗口，荧光信号与β-葡聚糖含量呈正相关。
2. 突变株筛选：经多轮UV诱变和流式分选获得突变株D6，其荧光强度显著高于野生型。
3. 高葡萄糖驯化：D6在高糖环境中进一步进化出D7菌株，葡萄糖利用率提高，产量提升65.18%。
4. 产物特性分析：发酵6天后，β-葡聚糖分子量降低，可能更利于生物活性发挥。

结论与意义
该研究首次将CBM4-BiFC系统应用于β-葡聚糖生产菌的高通量筛选，突破了传统方法效率低的限制。突变株D7的产量提升与分子量变化，为工业化生产高活性β-葡聚糖提供了优质菌种资源。技术路线可推广至其他微生物多糖的定向育种，具有重要的产业应用价值。研究由山东省科学院团队完成，获山东省重点研发计划（2022CXGC020206等）及国家自然科学基金支持。