嗜热真菌Rasamsonia emersonii D-氨基酸氧化酶热稳定性的结构决定因素解析

本研究针对嗜热真菌Rasamsonia emersonii的D-氨基酸氧化酶(ReDAAO)高热稳定性机制展开探索。通过构建随机突变库筛选获得5个热不稳定突变体(L134P、K203E、C230S、V275G、V305L)，其T50值较野生型降低12-18°C。研究发现这些突变通过破坏氢键网络、亚基间相互作用及独特二硫键等不同机制影响稳定性，揭示了嗜热真菌DAAOs特有的多重热稳定机制，为黄素酶工程改造提供新思路。

　　

在极端环境中生存的嗜热微生物，其酶系统往往具有惊人的热稳定性，这一特性对工业酶制剂开发具有重要价值。D-氨基酸氧化酶(DAAO)作为催化D-氨基酸氧化的黄素酶，在制药和生物催化领域应用广泛，但普通来源的DAAO常因热稳定性不足限制其应用。来自嗜热真菌Rasamsonia emersonii YA株的ReDAAO展现出优异的热稳定性，解析其分子机制不仅具有理论意义，更能为设计高热稳定性工程酶提供蓝图。

日本研究人员通过系统研究揭示了ReDAAO热稳定性的结构基础。研究采用误差倾向PCR构建随机突变库，筛选获得5个关键热不稳定突变体，测定其T₅₀(酶活性保留50%的温度)较野生型显著降低。通过X射线晶体学等结构分析发现，这些突变通过不同分子机制影响稳定性：L134P破坏表面柔性环的氢键网络；K203E干扰黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合与亚基相互作用的关键氨基酸网络；C230S消除稳定α螺旋的二硫键；V275G和V305L则破坏亚基界面相互作用。特别值得注意的是，二硫键和K203参与的作用网络是嗜热真菌DAAO特有的稳定机制。

关键技术方法包括：1)误差倾向PCR构建ReDAAO突变库；2)高通量筛选13,000个克隆获得热不稳定突变体；3)酶学表征测定T₅₀等热稳定性参数；4)结构分析解析突变对蛋白质构象的影响。

【Materials】
研究使用商业化的d-缬氨酸和分子生物学试剂，突变引物由专业公司合成，为实验提供可靠材料基础。

【Isolation of thermolabile ReDAAO variants】
通过大规模筛选获得5个单氨基酸取代突变体，其T₅₀值较野生型(68°C)降低12-18°C，其中L134P突变影响最为显著，证实这些位点对维持热稳定性至关重要。

【Discussion】
深入分析显示：1)L134P通过增加环区柔性降低稳定性；2)K203E破坏由K203、D307和R439组成的相互作用网络，该网络同时稳定FAD结合和亚基相互作用；3)C230S消除ReDAAO特有的C230-C290二硫键，导致关键α螺旋松动；4)V275G和V305L破坏亚基间疏水核心，其中V305L还可能影响亚基构象。这些发现揭示了嗜热真菌DAAO采用多种协同机制实现高热稳定性的分子原理。

【CRediT authorship contribution statement】
Takehiro Furuichi主导实验设计和论文撰写，Yuya Shimekake等参与资源提供和方法优化，Daiki Imanishi和Shouji Takahashi负责项目监督和资金支持，体现团队协作的研究模式。

该研究首次系统阐明了嗜热真菌DAAO的多重热稳定机制，特别揭示了二硫键和精氨酸相互作用网络等独特稳定策略。这些发现不仅丰富了极端环境酶适应机制的理论认知，更重要的是为理性设计工业用高热稳定性黄素酶提供了明确的分子靶点，对生物制造领域的酶工程应用具有重要指导价值。论文发表于《Journal of Bioscience and Bioengineering》，为相关领域研究树立了新标杆。