单细胞分辨率解析小鼠脑内神经类固醇中间生物合成的细胞与区域特异性图谱

本研究通过单细胞转录组技术首次绘制了小鼠大脑中介导神经类固醇（neurosteroids）中间生物合成的酶基因表达图谱，揭示了PREG（孕烯醇酮）下游生物活性类固醇合成的选择性区室化特征，发现SULT2介导的硫酸化反应不可逆、HSD3B/CYP17A1通路缺失等关键机制，为理解神经类固醇调控神经传递、认知行为及神经系统疾病治疗提供了细胞分子基础。

　　

在神经科学领域，神经类固醇（neurosteroids）作为中枢神经系统内合成的活性分子，长期以来被认为在调节神经传递、增强神经保护、调控免疫反应以及影响认知行为过程中扮演关键角色。与传统认知不同，大脑中的神经类固醇不仅可以通过胆固醇从头合成（de novo synthesis）产生孕烯醇酮（PREG），更依赖于将外周或局部的前体物质转化为活性神经类固醇的中间生物合成（intermediary biosynthesis）途径。然而，这些复杂转化过程涉及的特定细胞类型和脑区分布始终是未解之谜，这严重限制了对神经类固醇在生理和病理过程中精确调控机制的理解。

针对这一科学瓶颈，研究人员利用美国BRAIN Initiative Cell Census Network提供的单细胞转录组数据集，对95-222只小鼠（包括不同发育阶段和性别）的32种脑细胞类型进行了系统分析。通过10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）技术，结合严格的质控标准（如双重态评分<0.3、62个看家基因检测等），构建了迄今最全面的神经类固醇中间合成酶基因表达图谱。研究结果发表于《Journal of Endocrinology》，揭示了大脑神经类固醇合成的惊人区室化特征和性别差异。

关键技术方法包括：1）整合分析来自NeMO数据库的10xv2/v3单细胞转录组数据，覆盖小脑、下丘脑等13个脑区；2）使用Seurat v5进行细胞聚类和差异表达分析，设定Log₂ CPM≥1为表达阈值；3）t-SNE可视化展示基因表达的细胞类型和区域特异性；4）通过计算阳性细胞比例和表达总量评估酶活性潜力；5）分析4,041,289个细胞中2,381,293个雄性细胞和1,782,372个雌性细胞的性别差异。

研究结果首先通过细胞图谱分类建立了分析框架。t-SNE可视化显示小鼠大脑包含34种功能类别细胞，包括GABA能神经元、谷氨酸能神经元（如IT-ET、NP-CT-L6b等投射神经元）、多巴胺能神经元以及星形胶质细胞-室管膜细胞（Astro-Epen）等非神经元群体，为后续酶表达定位奠定基础。

在硫酸转移酶SULT2家族研究中发现，Sult2b1在IT-ET谷氨酸能神经元高表达，提示其优先催化PREG转化为PREG-S（孕烯醇酮硫酸盐）。而胆固醇硫酸酯酶（STS）的完全缺失表明大脑中类固醇硫酸化是不可逆过程，这与人类大脑存在显著物种差异。这种特性可能导致PREG-S和DHEA-S（硫酸脱氢表雄酮）在中枢神经系统持续积累，从而延长其对NMDA受体的兴奋性调节和对GABA_A受体的拮抗作用。

对孕酮合成关键酶HSD3B的分析显示，Hsd3b1/2/3的表达极低且局限，而Hsd3b7/8虽高表达但主要参与胆汁酸合成。值得注意的是，Cyp17a1几乎全脑缺失，表明小鼠大脑缺乏将PREG转化为DHEA或PROG转化为雄烯二酮的能力，这一发现挑战了既往关于脑内局部合成雄激素的传统认知。

在应激相关类固醇通路中，Cyp21a1/2和Cyp11b1/2的表达缺失提示小鼠脑内几乎无法合成DOC（脱氧皮质酮）或皮质酮。但Hsd11b1在Astro-Epen中高表达，显示其可能将外周11-脱氢皮质酮转化为活性皮质酮，形成独特的"外周-中枢"协同应激响应机制。

对神经活性最强的5α-还原类固醇研究发现，Srd5a1和Srd5a3在IT-ET谷氨酸能神经元和少突胶质前体细胞（OPC-Oligo）高表达，而5β-还原酶Akr1d1几乎不表达。这种选择性表达使得PROG、DOC和睾酮可被转化为5α-DHP（二氢孕酮）、5α-DHDOC和DHT（二氢睾酮），但无法逆向转化。随后的3α-还原步骤由Akr1c家族介导，其中Akr1c14在血管细胞特异性表达，可能参与生成ALLO（别孕烯醇酮）等强效GABA_A受体调节剂。

研究还揭示了HSD17B家族的复杂表达模式。虽然Hsd17b4/7/8/10/11/12广泛高表达，但其多数成员具有脂肪酸代谢等多重功能，仅Hsd17b7被证实可将雌酮转化为雌二醇。特别值得注意的是，芳香化酶Cyp19a1的表达局限于下丘脑GABA能神经元，表明脑内雌激素合成具有显著的区域特异性。

性别差异分析发现，松果体谷氨酸能神经元中Hsd3b7仅存在于雌性，而Hsd17b7和Srd5a3仅存在于雄性，提示性别特异性类固醇代谢可能影响昼夜节律调控。下丘脑内侧乳突区（HY-MM）的Srd5a1/3和Hsd17b4呈现雌性偏向，可能与应激反应的性别差异有关。

在讨论部分，作者强调这项研究首次在单细胞分辨率上揭示了神经类固醇中间合成的三大特征：一是合成步骤高度区室化，如SULT2B1介导的不可逆硫酸化与SRD5A介导的5α-还原分别位于不同细胞群；二是关键通路存在物种差异，如小鼠缺乏CYP17A1和STS表达；三是性别特异性表达模式可能影响神经内分泌调控。这些发现为理解神经类固醇在神经精神疾病（如抑郁症、癫痫）中的作用提供了新的分子框架，并为开发靶向特定合成酶的治疗策略奠定基础。例如，SULT2B1的高表达提示PREG-S可能成为认知增强的干预靶点，而SRD5A1/AKR1C通路的选择性激活可能用于焦虑障碍治疗。

该研究的局限性在于转录组数据不能直接反映酶活性，且部分酶（如HSD17B家族）的底物特异性尚不明确。未来需要通过蛋白质组学和代谢组学验证这些发现，并进一步探索神经类固醇合成与神经递质系统的交互调控机制。尽管如此，这项工作建立的细胞分子图谱将成为研究神经类固醇生理功能和治疗潜力的重要资源。