基于质谱的猪黏膜刮取样本蛋白质组学分析：实验操作与批次效应对数据变异的影响研究

【编辑推荐】本研究针对猪肠道黏膜刮取样本在蛋白质组学分析中存在的实验操作差异与批次效应问题，通过双实验者操作和分批次处理设计，结合DIA-MS和DIA-NN技术分析，发现实验者影响不显著但存在微小批次效应，为肠道蛋白质组学研究提供了标准化操作框架和数据校正策略。

　　

肠道黏膜研究是探索消化系统健康和疾病机制的重要窗口，而蛋白质组学技术为揭示黏膜分子特征提供了强大工具。然而，在样本采集和分析过程中，实验操作差异和批次效应如同"隐形干扰项"，可能扭曲真实生物学信号。以往研究多聚焦于采样方法比较（如刷检vs活检），却鲜少关注黏膜刮取技术本身的操作变异。这种知识空白使得研究人员难以区分数据差异究竟源于生物学变化还是技术偏差，尤其在大规模蛋白质组学研究中，标准化操作和变异控制的重要性愈发凸显。

针对这一挑战，比利时ILVO动物科学与技术研究所、食品科学部门与VIB-UGent医学生物技术中心的研究团队开展了一项创新研究。他们以12头饲喂不同日粮的仔猪为模型，系统评估了实验者操作和批次处理对猪空肠黏膜刮取样本蛋白质组数据的影响。该研究不仅填补了黏膜刮取技术标准化研究的空白，更为提高蛋白质组学数据可靠性提供了实践指南，相关成果发表在《Journal of Proteomics》。

研究采用差异分析（DIA）质谱技术结合S-Trap? midi柱蛋白提取方法，通过双实验者独立采集空肠六分体样本并分两批次处理的设计，运用DIA-NN软件和RStudio进行数据分析。在11,948-12,034个蛋白质的鉴定规模下，通过多维标度（MDS）分析和线性混合模型评估变异来源。

结果部分揭示：实验者因素未导致显著差异，但所有分析均检测到微小批次效应。在D1和D2数据集（不同日粮）中分别发现1个和4个潜在异常样本，经检验后保留用于后续分析。主成分分析（PCA）显示批次间存在可分离趋势，而线性混合模型确认批次对0.4%-1.7%的蛋白质有显著影响。值得注意的是，批次效应强度与样本处理间隔时间呈正相关。

讨论部分强调：严格标准化的操作流程可有效消除实验者差异，这与外科手术标准化研究结论相呼应。发现的批次效应虽微弱，但在多重假设检验背景下仍可能产生假阳性，建议采用ComBat等算法校正。研究还指出，冻干预处理相比液氮研磨在本研究中展现出更好的重现性优势。

结论确立了黏膜蛋白质组研究的质量控制框架：通过明确的操作规程可消除实验者变异，而批次效应需通过实验设计控制和统计校正。这项工作由De Rijcke Hanne领衔完成，其价值不仅在于具体发现，更在于建立了可推广的变异控制方法论，为肠道健康研究、营养干预评估等领域的蛋白质组数据解读提供了质量保证新标准。