苹果中柑橘凹胶相关病毒(CCGaV)一步法RT-qPCR检测技术的开发与应用

为解决苹果病毒病检测中因低病毒载量、混合感染导致的诊断难题，加拿大食品检验局研究人员开发了基于RNA1保守区的一步法RT-qPCR技术，可特异性检测柑橘凹胶相关病毒(CCGaV)。该技术为苹果无病毒种苗认证体系提供了关键工具，相关成果发表于《Journal of Virological Methods》。

　　

苹果作为全球重要的经济作物，其产量和品质正面临病毒病的严重威胁。在加拿大，苹果产业年产值高达2.93亿加元，但病毒导致的生长迟缓、果实品质下降等问题持续困扰着果农。其中，柑橘凹胶相关病毒(Citrus concave gum-associated virus, CCGaV)作为一种新发威胁，虽尚未被直接证实致病性，但已在全球多个苹果种质资源库中被检出，包括加拿大新斯科舍省的样本。这种属于Phenuiviridae科的负链RNA病毒，因其在木本植物中分布不均、含量低的特点，给传统检测方法带来巨大挑战。

针对这一难题，加拿大食品检验局植物健康中心的研究团队开展了一项创新性研究。他们意识到，现有检测技术难以满足种苗病毒净化计划对敏感性和特异性的双重需求——既要准确识别待处理病株，又要可靠验证净化后材料的无病毒状态。为此，研究团队选择CCGaV基因组中最保守的RNA1区段作为靶标，开发了一种具有广泛应用潜力的一步法逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测体系。

研究采用了多项关键技术：从苹果叶片中提取总核酸(TNA)时采用含4M异硫氰酸胍的裂解缓冲液；针对RNA1设计特异性引物探针；利用保存在植物健康中心活体库的阳性样本进行验证；通过生物信息学分析评估引物对所有NCBI数据库CCGaV分离株的覆盖度。样本队列包括来自加拿大、美国等多地的苹果种质资源，确保了研究的代表性。

样本收集和总核酸提取
研究团队从植物健康中心的活体病毒库中获取了CCGaV阳性样本及非目标病毒对照。采样策略科学严谨：在秋季采集植株各部位的3-4片叶片，集中其叶脉和叶柄组织约0.5g作为检测材料。这种取样方式有效解决了木本植物病毒分布不均的难题。

结果与讨论
开发的RT-qPCR检测体系展现出卓越性能：能特异性识别所有活体保存的CCGaV分离株，生物信息学分析证实其对NCBI数据库中全部病毒株系都具有检测能力。该方法解决了传统技术对木本植物病毒检测灵敏度不足的痛点，其创新性体现在三个方面：一是选择RNA1保守区确保检测广度；二是优化的一步法流程提升了检测效率；三是验证了在不同苹果组织中的适用性。

这项研究的结论具有重要意义：建立的RT-qPCR方法为苹果种苗病毒净化计划提供了可靠工具，填补了CCGaV特异性检测的技术空白。虽然该病毒与苹果衰退病的直接因果关系尚待证实，但作为预防性措施，该方法已应用于加拿大食品检验局的种苗认证体系。从更广视角看，这项研究为木本植物病毒检测建立了技术范式——通过靶向保守基因组区域、优化核酸提取策略、结合生物信息学验证，可有效克服低病毒载量、遗传多样性等诊断障碍。研究成果不仅服务于加拿大苹果产业，也为全球果树病毒防控提供了可借鉴的技术方案。