钴胺素变体调控MMACHC构象与寡聚化的分子机制：R161Q突变在cblC疾病中的致病机理研究

本研究聚焦cblC型甲基丙二酸血症合并高同型半胱氨酸血症的分子机制，通过多学科技术揭示了不同钴胺素（Cbl）变体（AdoCbl、MeCbl、CNCbl）与MMACHC蛋白结合的动态特性。研究人员发现R161Q突变通过长程效应破坏蛋白稳定性与二聚化能力，为理解cblC疾病的病理机制及靶向治疗开发提供了重要依据。

　　

钴胺素（维生素B₁₂）是人体代谢的关键辅因子，其生物活性形式甲基钴胺素（MeCbl）和腺苷钴胺素（AdoCbl）分别参与同型半胱氨酸转化和甲基丙二酸代谢。当MMACHC蛋白功能异常时，会导致cblC型遗传病——最常见的钴胺素代谢障碍，表现为神经认知障碍和多系统损伤。尽管已知MMACHC负责钴胺素的结合与加工，但不同钴胺素变体如何影响其构象动态及寡聚化状态尚不明确，尤其临床常见突变R161Q的致病机制亟待阐明。

意大利国家研究委员会生物物理研究所等机构的研究团队在《European Biophysics Journal》发表研究，综合运用圆二色谱（CD）、等温滴定量热法（ITC）、天然凝胶电泳和小角X射线散射（SAXS）等技术，系统分析了AdoCbl、MeCbl和氰钴胺素（CNCbl）与MMACHC的互作特征，并揭示了R161Q突变的致病机制。研究发现MMACHC的稳定性与寡聚化程度严格依赖于钴胺素类型，其中AdoCbl结合亲和力最高（K_d=15 nM），诱导最强的二聚化倾向；而R161Q突变通过破坏远距离分子内相互作用，显著降低所有钴胺素的结合效率，导致蛋白功能缺陷。

主要技术方法
研究采用ITC测定结合热力学参数，CD监测温度依赖性构象变化，SAXS分析溶液状态下的复合物尺寸，天然电泳评估寡聚体分布。实验使用重组表达的野生型MMACHC及R161Q突变体，结合三种钴胺素变体（AdoCbl、MeCbl、CNCbl）和谷胱甘肽（GSH）进行体系分析。

研究结果

钴胺素变体对MMACHC稳定性的差异调控
CD热变性实验显示，AdoCbl使野生型蛋白解链温度（T_m）提升最显著，CNCbl稳定效果最弱，符合ITC测得的亲和力排序（AdoCbl>MeCbl>CNCbl）。SAXS数据进一步证实AdoCbl-MMACHC复合物构象最紧凑，而MeCbl结合态柔性更高。

结合热力学的变体特异性
ITC揭示AdoCbl结合以显著焓变（ΔH=-17.6 kcal/mol）为主导，而CNCbl则呈现熵驱动特征。R161Q突变使所有钴胺素的结合焓降低，但部分通过熵补偿缓解自由能损失，表明突变引发长程构象扰动。

寡聚化平衡的变体依赖性
天然电泳证实AdoCbl促进野生型蛋白形成二聚体/四聚体，GSH协同增强该效应。R161Q突变体二聚化能力普遍减弱，且GSH无法挽救其寡聚缺陷，这与突变位于GSH结合域的特性一致。

结论与意义
该研究首次建立MMACHC结合亲和力-构象稳定