钙调蛋白融合表达技术实现同位素标记人α-防御素5的高效重组生产及其表达增强机制解析

本研究针对人α-防御素5（HD5）重组表达易降解、毒性高的难题，创新性地采用钙调蛋白（CaM）作为融合伴侣，在E. coli BL21(DE3)中实现HD5氧化型（HD5oxi）和还原型（HD5red）的高效可溶性表达，产量达1.5-1.7 mg/L。通过CD/NMR、分子动力学模拟揭示CaM与HD5的相互作用强度是稳定生产的关键，为β-折叠结构抗菌肽（AMPs）的重组策略提供新范式。

　　

在人体肠道免疫前线，α-防御素5（HD5）如同微型卫士，通过其独特的三维结构对抗病原微生物。然而这把"分子匕首"的双面性——氧化态（HD5_oxi）与还原态（HD5_red）的功能差异，以及工业化生产的瓶颈，始终困扰着研究者。传统方法中，6×His标签虽能提升表达量，但复杂的复性工序常导致二硫键错配；而β-折叠结构的刚性特征，又使得常规融合蛋白策略屡屡受挫。

日本科学振兴机构（JST）的Shaonan Yan、Tomoyasu Aizawa团队独辟蹊径，从钙调蛋白（CaM）的"分子拥抱"特性获得灵感。这种通常与α-螺旋结合的钙传感器，意外展现出对β-折叠结构AMP的兼容性。研究者构建pCaM-EK-HD5载体，在E. coli中实现可溶性表达，并通过Enterokinase酶切获得高纯度产物。稳定同位素标记技术的成功应用，为NMR解析HD5动态构象打开新窗口。

关键技术方法
研究采用CaM融合表达系统（含6×His标签和EK酶切位点），在E. coli BL21(DE3)中诱导表达；通过Ni²⁺亲和层析纯化后，使用Enterokinase释放目标肽段；结合圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）分析构象变化；运用分子动力学模拟揭示CaM-HD5相互作用机制；对比Origami（促进二硫键形成）与常规菌株的表达差异。

主要研究结果

1. 载体构建与表达优化
pCaM-EK-HD5载体通过KpnI/XhoI双酶切构建，CaM融合使HD5表达量提升3倍。有趣的是，即便在还原性胞质环境中，仍有15%的HD5_oxi自发形成正确二硫键。

2. 结构特征解析
CD谱显示CaM-HD5融合蛋白保留典型β-折叠特征（208 nm负峰）。NMR氢谱中HD5_red的分散度较差，而HD5_oxi出现明显化学位移，证实二硫键对结构稳定的关键作用。

3. 分子互作机制
模拟显示CaM通过N端和C端叶与HD5形成"三明治"结构，结合自由能-8.2 kcal/mol。关键残基Arg²⁸的突变实验证实，适度降低结合力可提升二硫键形成效率。

4. 功能活性验证
平板抑菌实验显示，HD5_oxi对S. aureus的MIC为8 μg/mL，是HD5_red的16倍；但后者对LPS的结合能力反而增强2.3倍，印证其潜在抗炎功能。

结论与展望
该研究突破性地证明CaM可作为β-折叠AMP的通用型融合伴侣，其"柔性保护"机制为难以表达的富含二硫键蛋白提供新思路。特别值得注意的是，CaM与目标肽的相互作用需保持"黄金平衡点"——过强会阻碍二硫键形成，过弱则无法抵抗蛋白酶降解。这一发现不仅推动HD5在感染性疾病和肠炎治疗中的应用，更为设计"智能型"融合标签奠定理论基础。未来通过定向进化改造CaM结合域，有望实现各类难表达肽的高通量生产。