靶向猪流行性腹泻病毒3CL蛋白酶的抑制剂筛选与抗病毒机制研究

为解决猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染缺乏特效药物的难题，研究人员通过虚拟筛选160万化合物库，结合分子动力学模拟和FRET酶活检测，发现小分子化合物Y041-1672可特异性抑制3CLpro（IC50 86.48 μM），显著降低病毒复制（EC50 17.97 μM），为开发新型抗冠状病毒药物提供了先导化合物和策略参考。

　　

猪流行性腹泻病毒（PEDV）引发的仔猪腹泻疫情具有近100%的致死率，给全球养猪业造成巨大经济损失。尽管疫苗接种可部分防控，但新生仔猪免疫系统发育不全，疫苗保护存在空窗期，亟需开发快速起效的抗病毒药物。PEDV的3C样蛋白酶（3CLpro）作为病毒复制的关键酶，负责切割病毒多聚蛋白形成功能性非结构蛋白，是理想的药物靶点。然而，现有天然产物抑制剂存在来源有限、成本高等缺陷，而合成小分子药物的开发仍缺乏系统性研究。

华中农业大学的研究团队通过计算机辅助药物设计结合实验验证，筛选出靶向PEDV 3CLpro的高效小分子抑制剂。研究采用虚拟筛选技术对160万化合物库进行初筛，结合分子力学/广义玻恩表面积（MM/GBSA）结合自由能计算，锁定4个候选化合物。通过100纳秒分子动力学模拟分析复合物稳定性（RMSD、RMSF、Rg等参数），并利用荧光共振能量转移（FRET）技术测定酶抑制活性。最终在细胞水平验证了先导化合物Y041-1672的抗病毒效果，相关成果发表在《Virologica Sinica》。

关键技术包括：1）基于AutoDock Vina和MM/GBSA算法的虚拟筛选；2）GROMACS软件进行的100 ns分子动力学模拟；3）FRET法检测3CLpro酶活及抑制剂IC₅₀；4）细胞水平的病毒复制抑制实验（RT-qPCR、空斑试验、免疫荧光）。

虚拟筛选与结合能计算
通过分子对接和结合自由能计算，从ChemDiv库中筛选出8个结合能<-8.8 kcal/mol的化合物，其中Y041-1672的MM/GBSA值达-70.71 kcal/mol，预示强结合能力。

化合物-蛋白相互作用分析
PyMOL可视化显示，Y041-1672通过酰胺-π堆积与催化残基His41结合，并与Asn141/Gly142形成氢键网络，同时其苯并呋喃核心通过疏水作用稳定结合口袋。

MD模拟验证复合物稳定性
100 ns模拟中，Y041-1672-3CLpro复合物的RMSD稳定在0.18-0.35 nm，显著低于游离蛋白酶。自由能景观（FEL）分析显示单一能量最低点，证实结合构象高度稳定。

3CLpro酶活与抑制测定
FRET实验证实Y041-1672呈剂量依赖性抑制（IC₅₀ 86.48 μM），优于同类化合物F366-0161（151.5 μM）。

体外抗病毒效果
在Vero细胞中，Y041-1672的CC₅₀>279.2 μM，EC₅₀为17.97 μM（SI=15.5）。Western blot显示50 μM可完全阻断病毒N蛋白表达，空斑试验证实其使病毒滴度降低5倍。

作用阶段特异性
时间添加实验表明，仅感染后给药能抑制病毒复制（RT-qPCR显示RNA拷贝数降低3.99×10⁸），提示其靶向病毒复制阶段的3CLpro功能。

该研究首次系统鉴定了靶向PEDV 3CLpro的合成小分子抑制剂，揭示了Y041-1672通过双重机制（竞争性占据活性位点与立体阻碍）抑制酶活性的结构基础。尽管其对猪δ冠状病毒（PDCoV）的交叉抑制较弱（仅100 μM有效），但模块化骨架为优化广谱抗冠状病毒药物提供了模板。分子动力学模拟与FRET技术的结合，为冠状病毒蛋白酶抑制剂的开发建立了多学科研究框架。未来可通过引入卤素取代基或稳定酯基等策略，进一步提升该先导化合物的效价和成药性。