模拟CD8 T细胞耗竭：一种全面研究免疫治疗耐药机制的新方法

《iScience》：Simulating CD8 T cell exhaustion: A comprehensive approach

本研究针对癌症免疫治疗中CD8 T细胞耗竭（T cell exhaustion）这一关键瓶颈，开发了可重复的体外慢性抗原刺激模型。研究人员通过系统表征耗竭T细胞的表型、功能和代谢特征，结合体内肿瘤模型验证，鉴定出小鼠与人类共有的259个核心耗竭相关基因（含25个转录因子）。该研究为解析PD-1/CTLA-4等免疫检查点抑制剂耐药机制提供了新工具，并为开发克服T细胞功能障碍的CAR-T疗法指明潜在靶点。

在癌症免疫治疗领域，PD-1/CTLA-4等免疫检查点抑制剂（ICB）虽取得突破，但仅对部分患者有效。究其根源，肿瘤微环境（TME）中长期存在的抗原刺激会导致CD8 T细胞进入耗竭状态（exhaustion），表现为功能衰竭、增殖能力下降和代谢异常。这种状态不仅削弱免疫系统抗癌能力，更是CAR-T疗法治疗实体瘤的主要障碍。尽管LCMV病毒感染模型曾揭示耗竭T细胞的某些特征，但缺乏能模拟肿瘤特异性T细胞耗竭的标准化研究工具，且耗竭过程中形态与代谢的动态变化尚未系统解析。

剑桥大学治疗免疫学与传染病研究所的Andrea J. Manrique-Rincón团队在《iScience》发表研究，通过构建新型体外耗竭模型，结合多组学分析，揭示了T细胞耗竭的时空演化规律。研究采用OT-I转基因T细胞（识别OVA_257-264肽段）进行连续抗原刺激，通过流式细胞术、代谢分析、电镜观察表征耗竭进程；建立MC38-OVA肿瘤模型区分不同免疫应答类型；利用RNA-seq和ATAC-seq解析转录组和表观遗传特征，并与人类肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）数据比对。

主要研究结果

A model of exhaustion in vitro that recapitulates the main hallmarks of exhaustion upon chronic stimulation
通过7轮抗原刺激建立的体外模型成功复现了耗竭核心特征：抑制性受体（PD-1、TIM-3、CD39）表达升高3-5倍，细胞周期停滞（EdU⁺ S期细胞减少50%），多功能性丧失（IFNγ⁺TNFα⁺双阳性细胞从24%降至<1%）。值得注意的是，颗粒酶B（Granzyme B）在耗竭细胞中异常高表达，与临床TIL表型一致。

In vitro exhausted cells have an altered metabolism and higher numbers of mitochondria
代谢分析显示耗竭细胞呈现"高耗能低效率"特征：线粒体质量增加2倍（MitoTracker染色和电镜验证），但呼吸储备能力（SRC）降低40%，葡萄糖摄取增加而ECAR（糖酵解速率）下降。电镜三维重建发现线粒体形态不规则（圆度指数降低15%），暗示氧化磷酸化（OXPHOS）系统紊乱。

Temporal acquisition of exhaustion phenotypes
时间进程实验揭示耗竭呈阶段性发展：第3次刺激后出现功能衰竭（细胞因子分泌减少），第5次刺激后线粒体异常积聚，而PD-1在早期激活后即持续高表达。值得注意的是，线粒体质量呈现双峰变化——在效应期（第2次刺激）和耗竭期（第5次刺激）分别达到峰值，提示代谢重编程具有动态适应性。

In vivo model of T cell exhaustion in response to cancer
MC38-OVA模型自发形成三类免疫应答：47.8%肿瘤完全消退（regressing），25.7%进入耗竭状态（exhausted），26.5%无应答（non-responsive）。单细胞分析显示，无应答肿瘤富含终末耗竭T细胞（Ly108^lowCD69^high亚群占40%），其线粒体膜电位（TMRE染色）比消退组高3倍，但葡萄糖摄取能力反而更低，揭示体内外代谢特征的差异性调控。

Transcriptomics signatures of exhaustion in vitro and in vivo
通过交叉比对发现259种保守基因（含Bhlhe40、Rbpj等关键转录因子），在人类泛癌T细胞图谱中显著富集于耗竭亚群（FDR<0.01）。ATAC-seq揭示25个共有的开放染色质区域（如Hoxa2 motif），为表观遗传调控提供新证据。

这项研究建立了首个整合形态-功能-多组学的T细胞耗竭研究框架，其核心发现具有三重意义：首先，体外模型可快速生成与临床相关的耗竭T细胞，克服了动物模型周期长、异质性高的局限；其次，鉴定出的核心基因签名为开发新型免疫治疗生物标志物（如CD39⁺TIM-3⁺双阳性亚群）提供依据；最后，线粒体形态动力学与代谢异常的关联，为通过代谢干预逆转耗竭（如增强OXPHOS）指明新方向。该成果对优化CAR-T设计、开发联合疗法具有重要指导价值。