抗VHH纳米抗体：多功能工具助力纳米抗体CAR-T细胞的表征、阻断与激活研究

本研究针对纳米抗体(VHH)基CAR-T细胞疗法开发中的关键需求，研发了两种鼠源单克隆抗体(2A3和3H12)。通过ELISA、SPR和氢氘交换质谱(HDX-MS)等技术证实，这些抗体能特异性识别骆驼源VHH的保守框架区，不与人类VH结构域交叉反应。研究发现，该抗体组合可实现对98%以上VHH蛋白的广谱识别，既能作为二级标记工具评估VHH分子活性，又能在可溶状态下阻断VHH-CAR-T细胞活化，而固定化时则能诱导730倍扩增并保持CD8/CD4异质性。该成果为纳米抗体免疫疗法的研发提供了标准化工具，发表于《Antibody Therapeutics》。

　　

在细胞免疫治疗领域，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已成为革命性突破，但传统单链抗体(scFv)构建的CAR存在分子量大、免疫原性高等局限。骆驼科动物来源的纳米抗体(VHH)因其体积小、稳定性高、人源化程度高等优势，正成为新一代CAR的理想选择。然而，缺乏标准化工具来表征、调控VHH-CAR-T细胞功能，严重制约了该领域发展。

加拿大国家研究委员会人类健康治疗研究中心的Scott McComb团队在《Antibody Therapeutics》发表研究，通过免疫小鼠获得2A3和3H12两种鼠源单克隆抗体。这些抗体特异性靶向骆驼源VHH的框架区(FR)，不干扰抗原结合区(CDR)功能，实现"一箭三雕"：作为检测工具可量化CAR表达；可溶性状态下阻断CAR-T激活；固定化时则能特异性扩增VHH-CAR-T细胞。

关键技术包括：1) 用FC5-VHH免疫A/J小鼠制备杂交瘤；2) 通过酵母表面展示(YSD)和HDX-MS进行表位作图；3) 表面等离子共振(SPR)分析结合动力学；4) 使用健康供体外周血单核细胞(PBMC)构建CAR-T模型；5) 体外细胞毒性实验评估功能。

研究结果
Identification of broadly cross-reactive anti-VHH mAbs
通过杂交瘤筛选获得37个FC5结合克隆，经人IgG阴性筛选后，2A3和3H12对5种VHH-CAR均显示强反应性，且不与scFv-CAR交叉反应。重组为IgG2a后保持_KD=2.4-192 nM的高亲和力。

Anti-VHH mAbs Show Differential Reactivity
ELISA检测76种VHH显示98.7%识别率。关键发现：3H12结合依赖FR1区S11位点（S11L突变可恢复结合），2A3则识别FR2区独特基序。

Hydrogen Deuterium Exchange Mapping
HDX-MS揭示3H12结合引起FR1(S6-S17)、FR2(Q₃₉-E₄₆)和FR3(V₆₃-F₆₇)氘交换率降低，形成不连续表位；2A3仅影响FR2区，证实二者结合位点相邻但不同。

Anti-VHH mAbs for Assessment of VHH Cellular Reactivity
成功应用于CD22⁺淋巴瘤和BCMA⁺骨髓瘤细胞的VHH结合检测，组织染色显示扁桃体滤泡特异性信号，验证其作为通用检测工具的可靠性。

Soluble Anti-VHH mAb Binding can Block VHH-CAR Reactivity
0.1 nM即可阻断EGFR-CAR-Jurkat细胞CD69上调，显著抑制SKOV3靶细胞杀伤（p<0.001），为CAR-T毒性控制提供新策略。

Immobilized Anti-VHH mAb Can Activate and Expand VHH-CAR Cells
平板固定抗体诱导VHH-CAR-T特异性增殖（平均730倍），CAR纯度>94%，且保持CD8/CD4平衡。值得注意的是，扩增后的细胞在长期培养中表现出抗耗竭特性，优于工程化增强的m971-scFv CAR（p<0.01）。

结论与意义
该研究开创性地开发出VHH-CAR领域"瑞士军刀"式工具：

1. 检测层面：解决VHH-CAR表达量化难题，替代传统荧光标记；
2. 调控层面：可溶性抗体为CAR-T毒性提供"紧急制动"，固定化抗体则实现抗原非依赖扩增；
3. 机制层面：首次解析VHH框架区表位特征，为优化CAR设计提供新靶点。

相较于抗独特型抗体或蛋白A等传统方法，这种双克隆抗体组合具有更广谱的适用性（覆盖76/76种VHH）和更稳定的产品特性（冻存12个月活性不变）。特别在临床转化方面，其标准化生产质控体系为VHH-CAR疗法从基础研究到产业化搭建了关键桥梁。未来，该技术或将推动纳米抗体在双特异性抗体、分子影像等领域的应用突破。