分枝杆菌蛋白质定位与邻近蛋白质组学研究：基于ALFA标签-纳米抗体的创新平台

这篇研究论文开发了一种基于ALFA标签和纳米抗体（NBALFA）的多功能系统，用于分枝杆菌（如结核分枝杆菌）的蛋白质定位、重定位及邻近蛋白质组学研究。通过将ALFA标签插入目标蛋白，并结合条件性表达的NBALFA融合荧光蛋白（如msfGFP）或邻近标记酶（TurboID），该系统成功实现了活细胞中胞质和膜蛋白的精确定位，并鉴定了RNA聚合酶复合物（RpoC）和PKS13（聚酮合酶13）的相互作用网络。该平台为微生物蛋白质功能研究提供了灵活工具，尤其适用于难操作病原体的生物学探索。

　　

摘要

结核病仍是全球重大健康威胁，而理解结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的蛋白质功能需要创新技术。本研究开发了基于ALFA标签和纳米抗体（NBALFA）的分裂系统，用于分枝杆菌的蛋白质定位与邻近标记。ALFA标签的小尺寸（仅18个氨基酸）和α-螺旋结构使其可灵活插入目标蛋白的N端、C端或内部，而NBALFA能通过融合不同功能模块（如荧光蛋白或TurboID）实现多重应用。

纳米抗体在分枝杆菌中的蛋白质定位

实验以快生长的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）为模型，将ALFA标签插入染色体编码的RpoC（RNA聚合酶β′亚基）和MmpL3（膜转运蛋白）的C端。通过共表达GFP-NBALFA，荧光信号成功重现了RpoC的核质定位和MmpL3的极性分布，与直接融合GFP的结果一致。Tet诱导系统可调控NBALFA表达量，避免过度表达干扰细胞生长。

蛋白质重定位的强制操控

通过将NBALFA与聚集序列ELK16或跨膜结构域MalF_(TM1,2)融合，研究团队实现了ALFA标签蛋白的定向重定位。例如，ELK16-GFP-NBALFA诱导形成包涵体后，mCherry-ALFA被特异性招募至聚集点；而MalF_(TM1,2)-GFP-NBALFA则将mCherry-ALFA拉向细胞膜。这些实验证明该系统可人为操控蛋白质亚细胞分布。

邻近蛋白质组学应用

TurboID-NBALFA与ALFA标签蛋白共表达后，在生物素存在下标记邻近蛋白质。在RpoC-ALFA菌株中，质谱鉴定出RNA聚合酶核心亚基（RpoA、RpoB）和终止因子Rho；而在结核分枝杆菌中，PKS13（参与分枝菌酸合成的关键酶）的四种ALFA标签变体均捕获到其已知互作蛋白（如AcpM、InhA、MmaA3等）。值得注意的是，标签位置（N端、C端或内部）影响了互作蛋白谱，提示结构域特异性相互作用。

讨论与意义

该系统的核心优势在于“分裂设计”：ALFA标签对目标蛋白干扰极小，而NBALFA可灵活搭载不同功能模块。相较于传统APEX/BioID，TurboID-NBALFA更适合分枝杆菌的胞内标记。未来可扩展至抗生素靶点动态互作研究或病原体-宿主界面探索。平台的高通用性暗示其或可推广至其他原核及真核系统。

材料与方法

研究使用耻垢分枝杆菌mc²155、结核分枝杆菌Erdman等菌株，通过同源重组构建ALFA标签菌株。蛋白质检测采用抗ALFA纳米抗体（1:5,000）和链霉亲和素-HRP（1:10,000）。邻近标记实验在无生物素的Sauton培养基中进行，以降低背景。质谱数据通过Spectronaut分析，采用DIA（数据非依赖采集）技术提高重复性。

创新点

1. 多功能性：单标签实现定位、重定位、互作组学三合一。
2. 时空控制：Tet诱导系统精确调控NBALFA表达窗口。
3. 结构兼容性：ALFA标签在PKS13（186 kDa）多结构域蛋白中仍保持功能。

该研究为分枝杆菌蛋白质功能研究提供了模块化工具，尤其对难以遗传操作的结核分枝杆菌具有重要意义。