综述：倾斜还是不倾斜？原位冷冻电镜数据采集策略

这篇综述深入探讨了原位冷冻电镜（cryo-EM）数据采集策略的权衡与优化，从单投影到断层扫描（cryo-ET）的连续谱系，强调如何通过剂量分配、倾斜方案设计（如混合策略）平衡高分辨率结构与细胞超微结构成像需求，为结构细胞生物学研究提供方法论指导。

　　

迈向广义结构细胞生物学

近年来，冷冻电镜（cryo-EM）技术的突破性进展将分辨率推至~1 ?水平，结合蛋白质结构预测的革新，科学家已能解析或预测大部分已知蛋白质组的结构。随着聚焦离子束（FIB）铣削技术的成熟，冷冻含水细胞的电子透明切片得以制备，为在细胞原位揭示蛋白质的排列与相互作用提供了可能。研究焦点正从纯化蛋白转向细胞内分子机器的三维构象与功能关联。

当前数据采集策略

冷冻断层扫描：窥见细胞超微结构

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）通过多角度倾斜成像重建三维断层图，可呈现20 ?分辨率的细胞超微结构，但辐射损伤限制了其分辨率提升。理论计算表明，即使采用液氦冷却或相位板等技术，细胞样本的信噪比（SNR）提升仍面临厚度（如200 nm样本SNR降低~2倍）与浓度（生理条件下300 mg/mL蛋白质浓度降低对比度30%）的双重挑战。克劳瑟准则（Crowther criterion）指出，10 ?分辨率需将单倾角曝光控制在<1 e^?/?²以下，目前技术难以实现。

平铺策略：高分辨率原位结构生物学

非倾斜数据采集结合二维模板匹配（2DTM）可最大化高分辨率信号。例如，核糖体原位结构可达2.2 ?，小分子结合位点清晰可见。但该方法依赖已知高分辨率模型，且计算成本较高。理论预测显示，在100 nm厚样本中，严格阈值下可识别最小300 kDa的蛋白质（若存在先验取向信息可降至25 kDa）。

混合策略：平衡的艺术

混合方法在首张非倾斜图像中分配高剂量（16–30 e^?/?²），后续进行标准倾斜系列，既能保留高分辨率信息，又通过断层扫描消除分子重叠干扰。例如，纤毛轴丝和兰尼碱受体的结构解析即受益于此策略。

策略谱系：从实验目标到方案设计

数据采集方案的选择需围绕生物学问题调整四个参数：倾斜数量、角度步长、采集顺序及剂量分配。例如：

• 案例1：线粒体膜重塑研究需~50 ?分辨率，按克劳瑟准则需188个投影（±60°倾角，1°步长），单倾角曝光1.4 e^?/?²。
• 案例2：原位高分辨率结构首选非倾斜策略，但若目标分子难以识别，可辅以稀疏倾斜（>3°步长）提升取向覆盖。
• 案例3：低丰度小蛋白鉴定需权衡2DTM与3DTM的灵敏度，后者曾成功识别100 kDa微管蛋白二聚体，但阈值宽松可能引入假阳性。

未来展望

辐射损伤与信噪比瓶颈仍是核心挑战。随着像差校正器（C_c）和激光相位板等硬件发展，以及算法优化（如神经网络预训练降低计算成本），原位冷冻电镜的边界将持续拓展。理论模型的完善将更精准指导策略选择，推动结构细胞生物学进入分子水平全景解析时代。