肾上腺皮质肿瘤循环miRNA分析的技术挑战与标准化研究：qPCR与dPCR方法学比较及抗凝剂影响评估

本研究针对肾上腺皮质肿瘤良恶性鉴别诊断中循环miRNA(miR-483-5p、miR-210-3p等)作为生物标志物的技术瓶颈，首次系统比较qPCR(实时定量PCR)与dPCR(数字PCR)的方法学差异，并揭示K2/K3-EDTA抗凝剂对检测结果的影响。结果表明两种PCR技术存在表达量依赖性偏差，且qPCR结果易受抗凝剂类型干扰，为循环miRNA检测标准化提供了关键实验依据。

　　

肾上腺皮质肿瘤的良恶性鉴别是临床面临的重大挑战，尤其恶性肾上腺皮质癌(ACC)五年生存率不足30%，而现有诊断主要依赖影像学检查。循环microRNA(miRNA)因其组织特异性表达模式和血液中的稳定性，被视为极具潜力的无创诊断标志物。然而，从实验室研究到临床应用仍存在巨大鸿沟——不同检测方法间的结果可比性、抗凝剂选择等技术细节缺乏统一标准，这些问题严重阻碍了miRNA标志物的转化应用。

为攻克这些技术瓶颈，匈牙利科学理事会资助的研究团队在《Endocrine-Related Cancer》发表重要论文。该研究创新性地采用配对实验设计，从20名受试者同步采集K2-和K3-EDTA抗凝血样，选取ACC相关miRNA(miR-483-5p、miR-210-3p、miR-21-5p)及内参(miR-16-5p、cel-miR-39-3p)，通过RT-qPCR和dPCR平行检测，结合Bland-Altman分析等方法系统评估技术差异。

关键技术方法包括：1）双抗凝剂配对采样（K2/K3-EDTA）；2）miRNeasy试剂盒提取血浆miRNA；3）TaqMan探针双平台检测（QuantStudio 7 Flex qPCR与QIAcuity One dPCR）；4）ΔCt与绝对定量数据的多维度统计分析。

研究结果揭示：

1. 方法学比较：qPCR与dPCR在四种miRNA检测中呈显著相关（P<0.05），但存在表达量依赖性偏差——低表达时qPCR高估、高表达时dPCR高估，这种比例偏差在miR-210-3p和miR-483-5p尤为突出。
2. 抗凝剂影响：qPCR检测中K3-EDTA样本的ΔCt值标准差更大（尤其cel-miR-39达1.28 vs K2的0.82），且除miR-483-5p外所有miRNA的ΔCt值均显示K2/K3间显著差异（P<0.05）；而dPCR结果完全不受抗凝剂类型影响。
3. 标准化关键：内参校正虽提高qPCR数据可比性，但会放大K2/K3差异，提示抗凝剂选择可能通过未知机制干扰逆转录效率。

讨论部分强调：这项研究首次揭示dPCR与qPCR在循环miRNA检测中不可直接互换，尤其在极端表达范围内。对于ACC诊断标志物miR-483-5p（其在恶性组织中可升高300倍），方法学差异可能导致临床截断值的误判。更值得关注的是，虽然EDTA是miRNA研究的金标准抗凝剂，但其亚型选择（K2/K3）竟能显著影响qPCR结果，这解释了多中心研究重复性差的潜在原因。

该研究的核心价值在于为循环miRNA检测标准化提供了实验框架：1）推荐dPCR作为低丰度miRNA检测首选；2）建议统一使用K2-EDTA抗凝剂；3）强调跨平台验证需建立校正因子。这些发现将加速miR-483-5p等ACC标志物的临床转化，也为其他疾病（如原发性醛固酮增多症）的miRNA研究树立了方法学规范。正如作者Peter Igaz团队指出，只有通过国际共识建立统一操作流程，才能真正释放循环miRNA在精准医疗中的巨大潜力。