靶向ROS-PI3K/AKT/FOXO3a通路：褪黑素通过调控氧化应激改善MYBPC3缺失型肥厚型心肌病表型的研究

为解决肥厚型心肌病(HCM)进展中氧化应激(ROS)的关键作用机制问题，郑州大学团队利用CRISPR-Cas9构建MYBPC3基因敲除(MYBPC3-KO)的人诱导多能干细胞源性心肌细胞(hiPSC-CMs)模型。研究发现ROS通过PI3K/AKT/FOXO3a通路驱动心肌肥厚向心力衰竭转化，而褪黑素可显著降低ROS水平、改善钙处理能力(Ca2+ transient)和收缩功能(contractility amplitude恢复72%)。该研究为HCM的靶向治疗提供了新策略。

　　

肥厚型心肌病(HCM)是一种威胁生命的遗传性心脏病，约40%-50%病例由肌球蛋白结合蛋白C3(MYBPC3)突变引起。尽管已知MYBPC3缺失会导致心肌肥厚，但其向心力衰竭进展的分子机制尚不明确。更关键的是，目前缺乏有效延缓疾病进展的治疗手段。近年研究发现氧化应激(ROS)在心血管疾病中起重要作用，但ROS是否驱动HCM恶化、能否成为治疗靶点仍是未解之谜。

为回答这些问题，郑州大学第一附属医院心血管团队构建了MYBPC3完全敲除(MYBPC3-KO)的人诱导多能干细胞源性心肌细胞(hiPSC-CMs)模型。通过长达40天的动态观察，首次揭示ROS通过PI3K/AKT/FOXO3a信号通路促进HCM表型恶化，并证实褪黑素可通过调控该通路显著改善疾病表型。这项突破性研究发表在《Genes》杂志，为HCM的机制研究和治疗提供了全新视角。

研究主要采用CRISPR-Cas9基因编辑构建MYBPC3-KO细胞系，通过心肌定向分化获得hiPSC-CMs。利用GCaMP6f钙成像技术监测钙瞬变，结合MitoTracker和MitoSOX检测线粒体功能及ROS水平。采用RNA测序分析差异表达基因，并通过Western blotting验证关键蛋白表达。所有实验均以野生型(WT)细胞为对照，部分实验加入10μM褪黑素干预。

Generation of homozygous MYBPC3 KO hiPSCs and their differentiation into CMs
研究团队通过靶向MYBPC3外显子2的sgRNA，成功获得双等位基因2碱基(GA)缺失的纯合敲除株。免疫染色证实KO细胞保持多能性标志物OCT4/SSEA4表达，且能分化为具有心室肌标志物MYL2的心肌细胞，分化效率与WT无差异。

MYBPC3-KO hiPSC-CMs show abnormal cardiac calcium handling and myocardial contractility
钙成像显示KO细胞在分化30天时Ca²⁺瞬变幅度增加，但40天时出现钙释放减少、衰减时间延长。收缩力检测呈现先增强(30天)后减弱(40天)的双相变化，模拟了HCM从代偿到失代偿的临床进程。

MYBPC3-KO hiPSC-CMs recapitulate the HCM phenotypes in vitro
KO细胞呈现典型HCM病理特征：40天时细胞面积增大50%、双核细胞增加10%，肥厚标志基因MYH7/NPPA/NPPB表达上调。RNA测序显示肥厚和氧化应激相关通路激活，抗氧化酶CAT/SOD/GPX1表达下调。

MYBPC3-deficient CMs activate oxidative stress
流式细胞术发现KO细胞在40天时总ROS和线粒体ROS(MitoSOX)显著升高，伴随PI3K/AKT磷酸化增强和FOXO3a磷酸化抑制。Western blotting证实p-AMPK表达增加，提示能量代谢紊乱。

MYBPC3-deficient CMs develop mitochondrial dysfunction
线粒体功能检测显示30天时线粒体DNA(ND1/ND2)增加，但40天时出现线粒体碎片化、膜电位(Δψm)下降。JC-1检测显示线粒体聚合体/单体比值降低，表明线粒体功能严重受损。

Melatonin alleviates HCM through PI3K/AKT/FOXO3a signaling pathways
关键发现是35天时ROS升高早于心衰表型出现。褪黑素干预5天后，KO细胞的ROS降低46%，Ca²⁺瞬变幅度恢复，收缩力达WT水平的72%。机制上，褪黑素抑制PI3K/AKT磷酸化，促进FOXO3a核转位发挥抗氧化作用。

这项研究首次系统阐明ROS在HCM进展中的动态作用：早期代偿阶段(30天)线粒体代偿性增生维持高收缩力，但持续钙超载导致ROS累积；失代偿期(40天)线粒体损伤引发"ROS诱导的ROS释放"恶性循环。通过靶向PI3K/AKT/FOXO3a通路，褪黑素可打破这一循环，这为临床干预提供了新思路。

研究创新性体现在三方面：①建立能模拟HCM全病程的hiPSC-CMs模型；②发现ROS水平变化可作为疾病分期标志；③证实褪黑素通过多靶点调控改善HCM表型。这些发现不仅深化了对HCM机制的理解，更为开发延缓疾病进展的抗氧化疗法提供了理论依据。值得注意的是，研究采用的10μM褪黑素浓度接近生理剂量，具有较好的临床转化前景。未来研究可进一步探索不同突变类型对ROS敏感性的差异，以及联合现有药物(如Mavacamten)的治疗策略。