基于BAC引导的单倍型组装策略提升木薯抗病毒基因座CMD2解析精度

本研究针对木薯(Manihot esculenta)基因组高度重复区域组装难题，开发了结合细菌人工染色体(BAC)测序与纳米孔超长读长(ULR)的组装流程，成功解析了抗花叶病(CMD)关键基因座CMD2的单倍型结构。通过比较抗病品种TME3与感病品种60444的基因组特征，新鉴定出31个潜在抗性基因，为理解木薯抗病毒机制提供了重要线索。该成果发表于《Genome Biology》，为复杂植物基因组组装树立了新标准。

　　

在热带地区，木薯作为重要的粮食安全作物养育着超过8亿人口，但其生产长期受到花叶病(CMD)的威胁。这种由双生病毒(Geminiviridae)引起的病害在撒哈拉以南非洲和印度次大陆肆虐，可导致作物减产高达90%。传统育种依赖的抗性基因座CMD2虽已被定位在8号染色体上，但由于木薯基因组高达61%的重复序列含量，这个关键区域的精确组装始终是科学界的难题。

比利时列日大学和鲁汶大学的研究团队创新性地将BAC克隆技术与第三代测序技术相结合，对抗病品种TME3和感病品种60444进行了深度解析。研究首先构建了覆盖7.6-8.3倍基因组的BAC文库，通过放射性探针筛选获得29个覆盖CMD2区域的BAC克隆。随后采用PacBio环状共识测序(ccs)获得高精度BAC序列，同时利用牛津纳米孔技术(ONT)产生>8kb的超长读长(ULR)。通过开发基于BAC序列比对的新型评估指标，研究人员从多种组装方案中筛选出Flye组装器结合>8kb读长的最优策略，使CMD2区域的BAC序列连续度提升至81.45%，显著优于既往组装版本。

关键技术包括：1)构建TME3和60444的BAC文库并进行多轮放射性探针筛选；2)采用PacBio RS II平台进行BAC克隆测序；3)使用MinION平台获取>8kb的纳米孔超长读长；4)结合光学图谱(Bionano)进行基因组支架构建；5)开发基于prPred算法的抗性基因预测流程。

结果

BAC引导的组装优化

比较分析显示，Flye组装器配合>8kb读长过滤的方案在CMD2区域表现最优，其BAC序列映射率达到81.45%（60444）和80.2%（TME3），较此前发布的参考基因组提升10-20个百分点。值得注意的是，公共数据库中的CMD2区域存在48处与遗传图谱不符的倒位事件，而新组装完美保持了标记顺序。

单倍型分辨率

研究首次在组装水平区分了CMD2的两个单倍型，其长度（2.18-2.31 Mb）与遗传图谱估算的1.88 Mb更为接近。相比之下，现有参考基因组将单倍型错误合并，导致CMD2区域膨胀至5.08-5.95 Mb（2.7-3.16倍）。

抗性基因挖掘

通过非屏蔽基因注释，在TME3的CMD2区域鉴定出157个基因，其中81个具有抗病潜力（prPred评分>0.1）。特别重要的是，31个基因在公共TME3基因组中缺失，包括9个在抗病材料中特异性表达的基因。这些基因中，5个已知参与拟南芥和烟草的抗病毒反应，为CMD2抗性机制提供了新的候选靶点。

结论与讨论

该研究建立的BAC评估框架为复杂植物基因组组装提供了质量标杆，其揭示的CMD2单倍型结构将抗性基因定位精度提升到新高度。发现的31个新型抗性候选基因（如参与DNA修复的MePOLD1同源基因）暗示CMD2抗性可能是多基因协同作用的结果，这挑战了传统单基因抗性的认知。研究者建议未来通过CRISPR编辑和病毒诱导的转录组分析验证这些候选基因功能。

这项工作不仅为木薯抗病育种提供了精准的基因组工具，其"BAC引导+ULR"的策略对其它高重复基因组研究具有普适意义。随着气候变化加剧病毒传播，这些发现对保障热带地区粮食安全具有重要价值。论文数据已存入NCBI（PRJNA981703）和ENA（PRJEB65447），包括6,221,230条纳米孔读长和55,296个BAC克隆序列，为后续研究提供丰富资源。