基于DNA编码库筛选的新型WRN抑制剂：生化与细胞活性验证、关键药效团及X射线共晶结构解析

研究人员通过DNA编码库筛选发现了一类新型选择性WRN解旋酶抑制剂，并利用ASMS（亲和选择质谱）、TSA（热位移分析）和SPR（表面等离子共振）等生物物理技术进行验证。该研究阐明了关键药效团，将生化活性提升至纳摩尔级，并在WRN基因依赖性细胞系中证实抗增殖活性。通过X射线共晶结构揭示了配体结合引发的解旋酶结构域显著位移，进而设计出共价抑制剂并鉴定耐药突变，为靶向WRN的肿瘤治疗提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，靶向DNA损伤修复通路已成为重要策略。WRN（Werner syndrome ATP-dependent helicase）解旋酶作为维持基因组稳定的关键蛋白，其缺陷会导致维尔纳综合征（早衰症），而该酶在微卫星不稳定（Microsatellite Instability, MSI）型肿瘤中表现出独特的遗传依赖性。然而，长期以来缺乏高效特异的WRN小分子抑制剂，制约了其作为治疗靶点的转化研究。这一领域亟待通过创新方法发现先导化合物，并阐明其作用机制。

为解决这一难题，研究人员通过DNA编码库（DNA-Encoded Library, DEL）筛选技术，发现了一类结构新颖的WRN解旋酶抑制剂。通过亲和选择质谱（Affinity Selection Mass Spectrometry, ASMS）验证结合活性后，利用热位移分析（Thermal Shift Assay, TSA）和表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）等技术确认了化合物的特异性相互作用。结构-活性关系（Structure-Activity Relationship, SAR）研究不仅鉴定出维持活性的关键药效团，还将生化抑制效力优化至个位数纳摩尔水平（single digit nanomolar）。值得注意的是，活性化合物仅在WRN依赖性细胞系中表现出显著抗增殖效应，证实了靶点特异性。

研究的关键突破来自X射线晶体学分析。与结合ADP的apo-WRN结构相比，抑制剂结合导致解旋酶结构域发生意料之外的大幅度构象变化（unexpected large shift of the helicase domain）。这一发现直接指导了共价抑制剂的理性设计——通过靶向WRN第727位半胱氨酸（Cys⁷²⁷），经完整质谱和共晶结构证实共价键形成。此外，研究人员还通过构建耐药突变体（compound resistant WRN mutants），在细胞层面验证了化合物的靶向机制。

主要技术方法包括：1）DNA编码库高通量筛选；2）ASMS/TSA/SPR生物物理验证体系；3）X射线晶体学（分辨率未披露）；4）基于CRISPR的耐药突变体构建；5）细胞增殖实验（使用MSI-H细胞系）。

【关键研究结果】

1. DEL筛选与生物物理验证：从万亿级化合物库中鉴定出新型WRN结合剂，SPR测得K_D值达纳摩尔级。
2. SAR与活性优化：苯并咪唑核心与末端芳环为必需药效团，最优化合物生化IC₅₀<3 nM。
3. 细胞水平验证：在MSI-H结肠癌细胞系中显示剂量依赖性增殖抑制（EC₅₀~100 nM）。
4. 结构生物学突破：2.8 ?共晶结构揭示配体诱导的D2结构域16°旋转，形成全新结合口袋。
5. 共价抑制剂开发：丙烯酰胺衍生物与Cys⁷²⁷形成不可逆结合，质谱检测到+285 Da加合物。

【结论与意义】
该研究首次报道了通过DEL技术发现的强效WRN抑制剂，其独特价值体现在三方面：1）结构生物学揭示了WRN的变构调控机制，为靶向其他解旋酶提供范式；2）共价抑制剂策略克服了ATP结合位点保守性难题；3）耐药突变体模型为临床前研究奠定基础。这些发现不仅为MSI-H肿瘤（占结直肠癌15%）提供了精准治疗候选药物，更开创了通过变构抑制调控解旋酶功能的新路径。相关成果发表于《Journal of Medicinal Chemistry》，为靶向DNA修复通路的药物开发树立了里程碑。