揭示雷公藤红素在结直肠癌中的潜在结合靶点：基于细胞热转移实验与脉冲蛋白水解联用的蛋白质组学分析

为解决雷公藤红素(Celastrol)在结直肠癌(CRC)治疗中作用靶点不明的问题，研究人员创新性整合细胞热转移实验(CETSA)与脉冲蛋白水解技术(PULSE)，通过二维电泳和MALDI-TOF质谱鉴定出EEF2、STIP1等8个潜在靶蛋白。该研究为阐明雷公藤红素的多靶点抗癌机制提供了新证据，并为靶向药物开发开辟了新途径。

　　

在癌症治疗领域，天然化合物雷公藤红素因其广谱抗癌特性备受关注，但其在结直肠癌中的具体作用靶点始终是未解之谜。传统化疗药物如5-FU和奥沙利铂虽能延长患者生存期，但耐药性问题日益突出，尤其是P-糖蛋白过表达导致的药物外排机制。与此同时，雷公藤红素虽被证实可通过HSF1–LKB1–AMPKα–YAP等多条通路抑制肿瘤，但既往发现的PRDX1/2等靶点无法完全解释其药理活性。这种机制认知的空白严重限制了该化合物的临床转化潜力。

为破解这一难题，中国台湾省某研究机构的研究人员开展了一项创新性研究，通过将细胞热转移实验(CETSA)与脉冲蛋白水解技术(PULSE)联用，首次建立了CETSA-PULSE分析体系。该团队在《Journal of Proteome Research》发表的成果显示，雷公藤红素可能通过结合EEF2、STIP1等8个关键蛋白发挥抗癌作用，其中FLNA的构象变化在生理温度下即被显著诱导。这一发现不仅为理解雷公藤红素的多靶点作用机制提供了分子基础，更为克服化疗耐药提供了新思路。

研究采用的核心技术包括：基于HCT116细胞模型的CETSA-PULSE联用技术，通过温度梯度实验结合Thermolysin蛋白酶消化去除变性蛋白；二维凝胶电泳(2DE)结合MALDI-TOF/TOF质谱进行靶蛋白鉴定；等温剂量反应指纹图谱(ITDRF)验证剂量依赖性结合效应；Western blot对关键靶点进行验证。

在"CETSA-Pulse是靶点鉴定的新型替代方案"部分，研究团队发现传统CETSA在58°C以上会出现非特异性蛋白增溶现象，而整合PULSE技术后成功消除该干扰。通过分析25-100 kDa和37 kDa条带，证实雷公藤红素仅与特定蛋白发生选择性相互作用。

"确认FLNA为潜在结合靶点"的结果显示，250-150 kDa区域的蛋白残留量显著降低，LC-MS鉴定出FLNA、CLH1和SPTN1三个候选蛋白。Western blot证实FLNA及其片段在100 μM雷公藤红素作用下，I₃₇值降低40-60%，表明药物结合诱导了早期构象变化。

"雷公藤红素可能干预8种结直肠癌相关蛋白"章节通过2DE联合质谱鉴定出EEF2、STIP1等8个差异蛋白，其中PRDX2与既往研究吻合。UniProt注释显示这些蛋白涉及氧化应激(GAPDH)、细胞骨架调控(FLNA)和蛋白折叠(STIP1)等关键通路。

在"体外验证潜在结合蛋白"部分，研究发现：STIP1的55 kDa片段在80 μM药物浓度下残留量锐减，提示特异性结合；GAPDH在61°C高温下仍能被160 μM雷公藤红素稳定；EEF2的37 kDa片段在药物保护下抵抗蛋白酶消化，其片段模式变化暗示构象重排。这些发现通过ITDRF_CETSA?PULSE得到剂量依赖性验证。

该研究的突破性在于：首次建立CETSA-PULSE联用技术，克服了传统方法对"粘性"化合物的局限性；发现FLNA等新靶点可能解释雷公藤红素的抗转移效应；揭示EEF2保护效应暗示其可能干预肿瘤蛋白翻译机制。特别是STIP1作为HSP70/90共伴侣蛋白的鉴定，为解释雷公藤红素调控热休克反应的经典理论提供了直接证据。

这些发现具有双重意义：方法论上，CETSA-PULSE为多靶点天然药物研究提供了新工具；生物学上，8个靶点的确定为雷公藤红素的精准用药奠定了分子基础。未来研究可进一步探索这些靶点与Wnt/β-catenin等已知通路的交叉作用，推动该古老药物向现代化疗方案的转化。