单氨基酸分辨率蛋白质测序技术精准鉴别肌钙蛋白异构体特异性肽段

为解决蛋白质异构体(proteoforms)的高相似性导致的鉴别难题，研究人员利用Platinum单分子蛋白质测序仪(NGPS)，以肌钙蛋白(TPM)家族为模型，成功区分了由基因旁系同源(paralogue)、可变剪接(spliceform)和翻译后修饰(PTM)产生的肽段变异，为疾病相关生物标志物的单分子检测奠定基础。

　　

在生命科学领域，蛋白质作为基因型与表型的关键桥梁，其复杂多样的异构体(proteoforms)一直是研究的难点。这些由基因突变、可变剪接(AS)和翻译后修饰(PTM)产生的变体，尽管结构高度相似，却可能引发截然不同的生物学功能甚至疾病表型。以肌钙蛋白(tropomyosin, TPM)家族为例，人类四种TPM基因编码的蛋白具有85%以上的序列相似性，但其突变与心肌病、骨骼肌疾病和癌症密切相关。然而，传统质谱(MS)技术难以区分单氨基酸变异，抗体检测又受限于特异性，这促使科学家寻求更精准的检测手段。

Quantum-Si的研究团队在《Journal of Proteome Research》发表的研究中，首次将商业化单分子蛋白质测序仪Platinum应用于异构体特异性肽段的鉴别。该技术采用半导体芯片纳米孔反应腔，通过荧光标记识别子(recognizer)可逆结合N端氨基酸(NAA)，结合氨基肽酶的逐步剪切，实现单肽链的实时测序。研究选取TPM1/2基因的旁系同源肽、组织特异性剪接变体肽及磷酸化酪氨酸(pTyr)修饰肽三类典型变异，通过脉冲持续时间(PD)和识别片段(RS)的动力学特征建立"指纹图谱"。

关键技术方法
研究通过计算机模拟Lys-C酶切筛选目标肽段，合成含C端叠氮赖氨酸的修饰肽，采用应变促进点击化学进行连接子偶联。使用Platinum测序系统（含12种NAA识别子）进行单分子测序，云端分析软件通过动态编程算法比对脉冲信号与参考序列，计算错误发现率。质谱验证采用纳流液相色谱-Orbitrap联用技术。

研究结果

基因旁系同源肽的鉴别
在ENALDRAEQAEADK(TPM1)/ENAIDRAEQAEADK(TPM2)这对异亮氨酸(Ile)/亮氨酸(Leu)异位肽中，LIV识别子对Leu的脉冲持续时间(0.35 s)显著长于Ile(0.23 s)。另一对VIESRAQK/VIENRAMK中，天冬酰胺(Asn)的PD值较丝氨酸(Ser)提高5倍，证实单识别子可区分结构相似氨基酸。

可变剪接肽段分析
针对TPM2外显子6特异性肽SLMASEEEYSTK，成功获取除蛋氨酸(Met)外所有位点的PD谱。外显子10/11差异肽TIDDLEETLASAK/TIDDLEDEVYAQK中，第8位亮氨酸(Leu)PD值较缬氨酸(Val)高9倍，第9位酪氨酸(Tyr)与丙氨酸(Ala)则通过不同识别子区分。

磷酸化修饰检测
在TIDDLEDEVYAQK磷酸化实验中，磷酸化酪氨酸(pY)导致YFW识别子结合事件减少70%，而LIV和谷氨酸(E)识别信号保持稳定，证明PTM可通过结合动力学变化被检测。

结论与展望
该研究首次实现单分子水平对蛋白质异构体标志肽的精准鉴别，突破传统质谱对异亮氨酸/亮氨酸等异位氨基酸的区分瓶颈。其意义在于：①为心肌病等TPM相关疾病的分子诊断提供新工具；②证实磷酸化等PTM可通过结合动力学间接检测；③推动蛋白质组学与基因组学的整合研究。尽管当前识别子覆盖度有限，但随着Quantum-Si新发布的Asp/Glu联合识别子等技术的迭代，未来在癌症新抗原筛选、过敏原检测等领域具有广阔前景。尤其值得注意的是，TPM作为甲壳类过敏原的主要成分，该技术或为食品安全检测开辟新途径。