德国熊蜂非致死性采样结合DNA条形码与宏条形码技术解析植物-传粉者网络关系的案例研究

为解决昆虫数量下降背景下传粉者觅食行为研究依赖致死性采样的难题，研究人员开发了一种基于COI条形码和ITS2宏条形码的非致死性采样方法，成功构建了德国北部保护区的植物-熊蜂互作网络。该技术通过截取中足跗节获取昆虫DNA，结合花粉刷取和分子鉴定，实现了对5种熊蜂及其18种访花植物的精准识别，为濒危物种生态研究提供了创新工具。

　　

全球昆虫种群正经历前所未有的衰退，传粉者的减少直接威胁着生态系统稳定性。熊蜂（Bombus spp.）作为关键传粉者，其独特的耐寒特性和"嗡嗡授粉"能力对多种植物（尤其是茄科植物）的繁殖至关重要。然而，传统研究依赖致死性采样获取花粉负载和昆虫DNA，这不仅加速了濒危物种的衰退，也无法动态监测蜂群全生命周期的觅食行为。更棘手的是，熊蜂中如B. lucorum复合体等物种仅靠形态学难以准确鉴别，而现有分子技术又需牺牲个体。这种矛盾促使科学家亟需开发兼顾科研精度与生态伦理的新方法。

德国研究团队在《Metabarcoding》发表的研究中，创新性地将蜂王标记笼、跗节截取术与高通量测序技术相结合。他们在德国北部的库克斯港海岸保护区（WDPA-ID: 329318）设立500米样带，使用改良的蜂王标记笼非致命性捕获21只熊蜂，通过精细刷取花粉篮颗粒并截取单侧中足跗节（证实不影响觅食能力），同步获取花粉和昆虫DNA样本。实验室采用ITS2宏条形码分析植物成分，COI条形码鉴定熊蜂物种，并建立包含58万条序列的定制数据库，结合植被物候调查验证数据可靠性。

Sampling
研究团队在2023年6月13日的4小时窗口期内，通过蜂王标记笼（原用于蜂王标记的Imgut?设备）轻柔固定熊蜂，经网孔用细毛刷采集花粉篮颗粒，随后无菌截取中足跗节。该方法确保昆虫存活率，且设备经10%次氯酸和70%乙醇严格消毒。

Molecular laboratory work
花粉DNA提取采用改良的NucleoMag试剂盒方案，针对ITS2区域设计特异性引物（ITS-3p62plF1/ITS-4T5unR1），通过30Hz珠磨破碎2.5分钟，PCR扩增后经Illumina MiSeq平台测序。熊蜂DNA使用DNeasy? Blood & Tissue Kit提取，LCO1490/HCO2189引物扩增COI基因片段，Sanger测序后通过NCBI数据库比对确认物种。

Data analysis
原始数据经APSCALE流程处理，包括VSEARCH去噪、LULU纠错和SINTAX分类。设置1%相对丰度阈值过滤假阳性，583,533条ITS2参考序列构建的定制数据库显著提升分类分辨率。

Results
形态学初筛发现12只熊蜂可明确鉴定（1只B. hypnorum、8只B. lapidarius和3只B. pascuorum），剩余9只经COI条形码解析为2只B. cryptarum、4只B. pascuorum和3只B. terrestris。ITS2分析从642,151条序列中鉴定出18种植物，其中三叶草属（Trifolium）出现在所有个体上，而B. pascuorum独有野豌豆属（Vicia）花粉。植被调查验证了13种植物与分子结果一致，但发现4种开花植物未检出DNA，推测因熊蜂最大觅食半径（>800 m²）超出样带范围。引人注目的是，尽管桃树（Prunus persica）未在保护区内记录，其花粉仍被检出，可能源自周边居民区观赏树种。

Discussion
该研究首次实现熊蜂研究的"零死亡率"突破：跗节截取术较传统整虫粉碎法减少99%伤害，蜂王标记笼设计将操作时间控制在3分钟内。技术层面，公开数据库的局限性导致部分植物仅能鉴定到属级（如蔷薇属Rosa sp.），但区域特异性参考序列的补充可改善此问题。生态学意义在于揭示了B. cryptarum的重新出现，以及B. pascuorum对豆科植物的特殊偏好，这些发现为针对性保护策略提供依据。

Conclusion
这项研究建立了非致死性采样-双条形码联用的标准化流程，成功绘制德国海岸荒地植物-熊蜂互作网络。方法学创新体现在：①蜂王标记笼实现无损伤固定；②跗节采样兼顾伦理与数据质量；③ITS2/COI双标记系统提升分辨率。该技术特别适用于受保护物种的长期监测，未来通过微型化设备改造，可扩展至其他传粉昆虫研究。研究结果印证了IPBES报告倡导的"生态友好型监测"理念，为全球生物多样性保护提供了可复制的技术范本。