口腔黏膜上皮细胞在复合培养基与无外源物培养基中的DNA损伤比较研究：为眼表移植安全提供新证据

本研究针对眼表移植中关键细胞来源——口腔黏膜上皮细胞(OMECs)的基因组稳定性问题，创新性比较了复合培养基(COM)与无外源物培养基(XF)的培养效果。通过微核试验(MNi)和彗星试验(comet assay)检测发现，两种培养基培养的OMECs在DNA链断裂(SBs)、碱不稳定位点(ALS)及Fpg敏感位点等指标上均无显著差异，证实XF培养基在保证基因组稳定性方面与COM培养基等效，为临床减少动物源性成分风险提供了重要依据。

　　

研究背景与意义
角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)是导致视力障碍的重要疾病，当角膜缘上皮干细胞(LESCs)因化学烧伤或遗传疾病受损时，传统治疗面临供体匮乏和免疫排斥的困境。口腔黏膜上皮细胞(OMECs)作为自体细胞来源展现出临床潜力，但其体外培养过程中基因组稳定性问题始终是安全移植的关键瓶颈。现有培养体系多依赖含动物源性成分的复合培养基(COM)，存在病原体传播和免疫风险，而无外源物培养基(XF)虽安全性更高，却缺乏系统的基因组稳定性验证。

捷克查理大学等机构的研究团队在《Mutagenesis》发表的研究，首次通过多维度DNA损伤检测，系统评估了OMECs在COM与XF培养基中的基因组完整性差异。研究发现两种培养基培养的细胞在微核频率(5.67‰ vs 6.17‰)、DNA链断裂(0.26% vs 0.31%尾DNA)和氧化损伤(5.33 vs 2.96 net Fpg敏感位点)等指标上均无统计学差异，证实XF培养基可完全替代传统COM培养基，为临床标准化无动物成分培养方案提供了决定性证据。

关键技术方法
研究采用7例死后27.9±10.7小时获取的口腔黏膜样本，在纤维蛋白支架上平行培养于COM（含10种添加剂）和XF（仅含10%人血清）培养基。通过倒置显微镜动态监测细胞形态后，分别采用：

1. 无胞质分裂阻滞的微核试验评估染色体断裂/丢失；
2. 碱性彗星试验检测DNA链断裂(SBs)与碱不稳定位点(ALS)；
3. Fpg酶修饰彗星试验定量8-氧鸟嘌呤等氧化损伤。

研究结果
细胞培养特征
培养13.7±1.0天后，两组细胞均达到85-95%汇合度，COM组仅提前1天达汇合。形态学观察显示两组细胞在大小、存活率方面无差异。

微核试验结果

COM与XF组的微核频率分别为5.67±1.45‰和6.17±1.64‰(p=0.59)，均处于鼻上皮细胞等快速增殖组织的正常范围，表明培养基类型不影响染色体稳定性。

彗星试验结果

DNA链断裂水平：

• COM组：0.26±0.18%尾DNA
• XF组：0.31±0.20%尾DNA
  氧化损伤水平(net Fpg敏感位点)：
• COM组：5.33±4.62%尾DNA
• XF组：2.96±1.98%尾DNA

讨论与结论
该研究首次证实OMECs在XF培养基中培养两周后，其DNA损伤水平与COM培养基相当，且氧化损伤指标还呈现降低趋势（虽未达统计学意义）。特别值得注意的是，XF培养基中net Fpg敏感位点均低于12%的背景阈值，完全符合临床安全标准。

研究突破性发现在于：

1. 推翻"简化培养基可能增加基因组不稳定性"的假设，证实人血清足以维持DNA修复机制；
2. 建立纤维蛋白载体培养-酶消化收获的技术可行性，为临床细胞存储提供方案；
3. 为欧盟《组织工程产品法规》要求消除动物成分提供实验依据。

该成果直接推动LSCD治疗向更安全方向迈进，未来研究可扩大样本量并延长培养周期观察长期效应。正如作者Katerina Jirsova强调的："这项研究为无外源物培养体系在再生医学中的广泛应用扫清了关键安全性障碍。"