神经干细胞来源外泌体通过破坏RIPK1-RIPK3相互作用抑制神经元坏死性凋亡促进脊髓损伤修复

脊髓损伤(SCI)治疗面临细胞疗法局限性大、坏死性凋亡机制不清等难题。中山大学团队创新性采用神经干细胞外泌体(NSC-Exos)联合注射方案，首次揭示其通过泛素-蛋白酶体通路(UPS)促进RIPK1泛素化，破坏RIPK1-RIPK3互作抑制坏死性凋亡，显著改善小鼠运动功能。该研究为无细胞疗法提供新策略，发表于《Bioactive Materials》。

　　

脊髓损伤是全球范围内致残率最高的创伤性疾病之一，每年导致数十万人终身瘫痪。传统治疗手段收效甚微，而干细胞移植虽具潜力却面临存活率低、免疫排斥和伦理争议等瓶颈。更棘手的是，损伤后爆发的神经元程序性死亡——尤其是近年来发现的坏死性凋亡(necroptosis)机制尚未阐明。这种由RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴主导的炎症性死亡方式，如同"细胞自杀炸弹"，会释放大量损伤相关分子模式(DAMPs)加剧继发性损伤。

针对这些挑战，中山大学的研究团队将目光投向神经干细胞外泌体(NSC-Exos)——这种直径仅30-150 nm的天然纳米囊泡，既能规避细胞疗法的缺陷，又富含母细胞的治疗性物质。研究人员创新性地采用硬膜外联合静脉注射方案，通过活体成像技术证实该策略能使外泌体在损伤部位富集效率提升2倍。令人振奋的是，治疗组小鼠在28天内实现从踝关节运动到协调步态的阶梯式功能恢复，运动诱发电位(MEPs)振幅翻倍，损伤区域缩小40%。

为揭示机制，团队构建了经典的TSZ(TNF-α+SMAC+Z-VAD-FMK)诱导神经元坏死性凋亡模型。透射电镜捕捉到NSC-Exos处理组细胞膜完整性显著改善，流式细胞术显示caspase-8^-/PI⁺的坏死性凋亡细胞减少60%。分子层面研究更发现：NSC-Exos能特异性降低p-RIPK1(Ser166)和p-MLKL(Ser358)磷酸化水平，通过免疫共沉淀(CoIP)证实其破坏RIPK1-RIPK3互作达70%，抑制坏死小体(necrosome)形成。

全转录组测序揭开关键转折——泛素-蛋白酶体通路(UPS)显著富集。当用MG132阻断蛋白酶体活性后，NSC-Exos的疗效被逆转。深入分析锁定核糖体蛋白S27A(RPS27A)，该分子在神经元内可激活XIAP、BIRC2等E3泛素连接酶，促使RIPK1发生K48位多聚泛素化而被降解。siRNA敲低RPS27A后，RIPK1-RIPK3复合物重新聚集，证实这是外泌体发挥作用的关键靶点。

这项研究首次系统阐明NSC-Exos通过UPS-RPS27A轴调控坏死性凋亡的新机制，为脊髓损伤提供"无细胞治疗"新范式。外泌体相较于干细胞更易标准化制备和储存，其联合给药方案更具临床转化潜力。更深远的意义在于，该发现为阿尔茨海默病、中风等涉及坏死性凋亡的神经系统疾病治疗开辟了新思路。

关键技术方法
研究采用Allen打击法构建小鼠SCI模型，通过超速离心结合尺寸排阻色谱法分离NSC-Exos，运用IVIS活体成像追踪DIR标记外泌体的体内分布。体外采用TSZ诱导原代脊髓神经元坏死性凋亡，结合LDH释放实验、透射电镜和流式细胞术评估疗效。分子机制研究涉及CoIP、非变性凝胶电泳检测MLKL寡聚化，以及RNA-seq与蛋白质组学联合分析。

主要研究结果

1. 外泌体递送优化：硬膜外联合静脉注射使DIR标记的NSC-Exos在损伤部位富集效率较单一途径提升2倍(图1G-H)。

2. 功能恢复显著：治疗组小鼠14天时实现协调性 plantar stepping，BMS评分提高3分(图2B-C)，28天时MEPs振幅达1.117±0.088 mV(图2E-G)。

3. 组织修复证据：Nissl染色显示神经元数量增加2倍，平均面积扩大40%，IBA-1⁺小胶质细胞浸润减少50%(图3A-B)。

4. 坏死性凋亡抑制：GSEA分析显示损伤周边区坏死性凋亡信号最显著(图3C-D)，Western blot检测到p-MLKL降低60%(图3E-F)，免疫荧光显示p-RIPK1/p-RIPK3/NeuN三阳性细胞减少70%(图4E)。

5. 分子机制解析：非变性电镜显示RIPK3四聚体形成被抑制(图6C)，CoIP证实RIPK3-RIPK1结合减少80%(图6E)。转录组-蛋白质组联合分析锁定UPS通路(图7A)，RPS27A敲除后RIPK1泛素化水平下降5倍(图8I-J)。

结论与展望
该研究不仅证实NSC-Exos能跨血脊髓屏障抑制神经元坏死性凋亡，更创新性发现其通过RPS27A介导的泛素化途径破坏RIPK1-RIPK3互作。这种"双管齐下"的作用机制——既阻断死亡信号传导又激活蛋白质降解通路，为开发靶向坏死性凋亡的精准疗法奠定基础。未来研究可进一步优化外泌体载药技术，探索其在慢性脊髓损伤中的应用价值。鉴于UPS通路在多种退行性疾病中的核心地位，该发现或将为神经保护策略提供普适性框架。