基于工程化肽支架的多聚体siRNA-GalNAc偶联物高效递送系统的开发与评价

本研究针对传统寡核苷酸药物(ONT)单靶点递送效率低、肾脏清除快等问题，创新性地采用肽支架构建可携带2-4个siRNA的多聚体偶联物。通过SPAAC点击化学实现GalNAc靶向修饰，系统评估了线性/环化肽架构及内体逃逸域等功能模块，证实四聚体siRNA-GalNAc静脉给药可显著增强肝脏靶向性（肝/肾分布比提升10倍），同时减少75%配体用量。发表于《Bioconjugate Chemistry》的这项工作为多价ONT设计提供了新范式。

　　

在生物医药领域，寡核苷酸药物(ONT)的靶向递送始终面临两大挑战：单一靶向配体携带的寡核苷酸数量有限，以及小分子siRNA因尺寸过小易被肾脏快速清除。传统GalNAc-siRNA偶联物虽能实现肝脏递送，但每个三触角GalNAc仅能携带一个siRNA，且约50%给药剂量会蓄积在肾脏引发潜在毒性。近年来，Khvorova实验室通过小分子连接体构建多聚siRNA，证实该策略可增强组织滞留和基因沉默效果，但化学连接体的结构可调性有限。

针对这些技术瓶颈，药明康德研究团队在《Bioconjugate Chemistry》发表创新性研究成果。研究人员另辟蹊径，设计出基于工程化肽支架的多价siRNA递送系统。该平台通过精确控制的三正交反应：1）核心azido-lysine与DBCO/BCN修饰siRNA的SPAAC点击化学；2）末端lysine与GalNAc-PFP酯的酰胺偶联；3）可选的双靶向半胱氨酸-马来酰亚胺连接，实现2-4个siRNA与单个GalNAc的模块化组装。特别值得关注的是，该团队创新性地引入可环化谷氨酸，首次实现siRNA多聚体的拓扑结构调控。

关键技术方法包括：1）采用非变性LCMS表征大分子复合物；2）建立HEK293-ASGPR1过表达细胞和原代人肝细胞(PHH)双模型评价体系；3）动态光散射(DLS)测定流体力学直径；4）血浆蛋白结合实验；5）小鼠静脉/皮下给药PK-PD研究（样本来自药明康德宁波公司SPF级动物房）。

研究结果部分，首先在"siRNA多聚体的设计与合成"中，团队证实含2-4个azido-lysine的线性肽（如Ac-KWPZZZZSE-NH₂）能高效完成SPAAC反应，四聚体组装率达75%。有趣的是，DBCO修饰链反应速率是BCN的2倍，但四聚体产率受空间位阻限制。随后的"多聚siRNA细胞摄取与活性"实验显示，单个GalNAc可有效介导四聚体（6.8nm）内化，在PHH中IC₅₀达nM级。特别值得注意的是，连接子可切割性（L/D型氨基酸、PO/PS键）对活性无显著影响，提示RISC复合物可直接加载支架结合的guide链。

在"二聚siRNA作用机制"研究中，团队发现5'-磷酸化(5'P)guide链对3'-HA连接构型至关重要——未预激活的tetramer活性降低60%，这为多聚体设计提供了关键参数。"概念验证扩展"部分则展示了双靶向PPIB-SOD1嵌合体的成功构建，以及环化肽（通过Glu(OAll)介导的头尾环化）和GALA3/H₁₂内体逃逸域的引入，虽然后者未显著提升沉默效果。

生物物理表征揭示：四聚体直径6.8nm（单体2.7nm），且环化不影响尺寸但改变聚集特性。血浆结合实验发现，四聚体蛋白结合能力是单体的3倍，这种"分子胶"效应可能源于局部PS密度和三维构象的协同作用。最终的"体内生物分布"研究获得突破性发现：静脉注射四聚体可实现10:1的肝/肾分布比（单体为1:1），且1.7mg/kg剂量下沉默效率比等效ONT量的单体高37%。这主要归因于：1）超过肾小球滤过阈值（6nm）；2）增强的血浆蛋白结合延缓清除；3）可能的"siRNA库效应"。

讨论部分强调，该研究首次系统论证了肽支架在多聚ONT递送中的独特优势：1）精确的化学计量控制（vs LNP的异质性）；2）模块化架构设计（线性/环化/功能域）；3）显著的药效学改善（四聚体ED₅₀降低4倍）；4）降低靶向配体相关毒性风险。特别值得关注的是，研究揭示了分子尺寸与肾脏清除的定量关系——6.8nm四聚体可有效规避肾小球滤过，这为其他肾脏毒性敏感药物提供了设计参考。尽管皮下给药显示多聚体跨血管屏障受限，但作者指出该平台在局部给药（如眼、CNS）和双靶向治疗中仍有巨大潜力。这项发表于ACS旗舰期刊的工作，为下一代智能ONT递送系统开发奠定了坚实基础。