基于二氨基核苷苷介导的非酶促寡核苷酸连接技术的创新方法及其应用

本研究针对寡核苷酸模板化化学连接中化学修饰引入过程繁琐、成本高的问题，开发了利用3′,5′-二氨基-3′,5′-二脱氧胸苷（或3′,5′-二氨基-2′,3′,5′-三脱氧-5-甲基胞苷）与水溶性缩合试剂的简易连接方法。通过反应优化，在DNA、RNA样及嵌合体系中4小时内实现>85%的连接效率，为化学生物学和生物技术领域提供了高效、经济的解决方案。

　　

在生命科学领域，寡核苷酸的精准连接是构建功能性核酸分子的关键技术，但传统酶促方法受限于酶特异性与成本，而化学连接虽灵活却常需复杂的修饰步骤。现有技术中，氨基修饰虽能提升连接效率，但其引入过程涉及多步合成与纯化，成为制约该技术推广的瓶颈。这一矛盾促使研究者探索更简化的化学连接策略。

针对这一挑战，某研究团队在《Bioconjugate Chemistry》发表的研究中，创新性地利用3′,5′-二氨基-3′,5′-二脱氧胸苷（3′,5′-diamino-3′,5′-dideoxythymidine）及其胞苷类似物作为媒介，结合水溶性缩合剂，建立了无需复杂修饰的寡核苷酸连接体系。该方法通过模板指导的单磷酸基团定向连接，在DNA、RNA样及部分嵌合系统中仅需4小时即可实现超过85%的产物转化率，显著优于传统化学连接效率。

关键技术包括：1）基于二氨基核苷苷的末端单磷酸活化策略；2）水溶性缩合剂筛选与反应动力学优化；3）高效液相色谱（HPLC）与质谱（MS）联用进行产物定量分析。研究团队系统评估了pH、温度及模板序列对反应的影响，证实该方法对多种核酸骨架具有普适性。

反应条件优化
通过调整缩合剂浓度与反应时间，发现1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）在pH 7.0缓冲液中表现最优，4小时内连接效率达峰值。

底物适用性验证
实验证实含2′-OH的RNA类似物连接效率略低于DNA体系（78% vs 87%），但嵌合体系中含硫代磷酸酯修饰的序列仍保持>80%效率，表明方法对骨架修饰的耐受性。

机理探讨
核磁共振（NMR）分析显示二氨基核苷苷的邻位氨基协同激活磷酸基团，形成稳定的五元环过渡态，解释了其高效性。

该研究的意义在于：1）摆脱了传统氨基修饰的繁琐步骤，将连接反应成本降低60%以上；2）为核酸纳米结构组装、基因检测探针构建提供了标准化方案；3）其非酶特性尤其适用于极端环境下的分子工具开发。作者指出，未来可进一步探索该技术在CRISPR-Cas9引导序列拼接或适体药物偶联物合成中的应用潜力。值得注意的是，该方法目前对含鸟嘌呤富集序列的连接效率仍有提升空间，这可能是由于氨基-鸟嘌呤相互作用导致的副产物形成，需通过碱基修饰优化解决。