4′-C-胆固醇/吡啶基-2′-O-甲基尿苷修饰siRNA的稳定性与无载体基因沉默效应研究

为解决siRNA(小干扰RNA)的细胞摄取效率低、代谢稳定性差等问题，研究人员通过铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC)合成了4′-C-胆固醇-2′-O-甲基(4′-C-chol-2′-OMe)和4′-C-甲基吡啶-2′-O-甲基(4′-C-Mpy-2′-OMe)尿苷缀合物，并证实其在siRNA 3′端修饰可显著增强核酸酶抗性，实现无载体条件下的高效基因沉默，为RNAi疗法开发提供了新策略。

　　

研究背景
RNA干扰(RNAi)技术作为基因治疗的重要手段，其临床应用长期受限于siRNA的稳定性与递送效率。未经修饰的siRNA易被核酸酶降解，且缺乏有效的细胞穿透能力，传统脂质体转染剂又可能引发免疫反应。如何通过化学修饰实现siRNA的自我递送(self-delivery)成为领域热点。胆固醇修饰虽能通过脂蛋白途径促进摄取，但单一修饰往往影响RNA诱导的沉默复合体(RISC)组装效率。

研究方法
中国科学院团队在《Bioconjugate Chemistry》发表研究，采用铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC)构建新型双功能尿苷衍生物：将胆固醇或吡啶基团通过C4′位连接2′-O-甲基尿苷，并定点修饰于siRNA双链3′突出端。通过圆二色谱分析二级结构，蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)评估核酸酶抗性，荧光素酶报告系统检测抗Renilla siRNA沉默效率，分子对接模拟4′-C-Mpy-2′-OMe与hAgo2蛋白PAZ结构域的相互作用。

研究结果

1. 化学修饰与稳定性
   4′-C-Mpy-2′-OMe修饰在poly dT₂₀的倒数第二位时，SVPD降解半衰期延长3倍，证明吡啶基团的空间位阻可有效阻断3′外切酶作用。

2. 基因沉默效率
   在抗Bcl-2 siRNA的乘客链(passenger strand)3′端引入4′-C-Mpy-2′-OMe，既保持RISC组装活性，又使内源性Bcl-2 mRNA水平下降70%，显著优于未修饰组。

3. 无载体递送效果
   双链3′端同时胆固醇修饰的siRNA，在1000 nM浓度下无需转染剂即可实现持续沉默：48小时抑制率68%，96小时达93%，证实C4′位连接能避免干扰RISC功能。

4. 结构机制解析
   分子动力学模拟显示，引导链(guide strand)3′端的4′-C-Mpy-2′-OMe与hAgo2的PAZ域仅形成微弱疏水作用，其吡啶环取向远离催化中心，确保靶mRNA切割活性不受影响。

结论与意义
该研究创新性地将疏水基团(胆固醇)与芳香杂环(吡啶)通过C4′位共价连接siRNA，首次证明：① 吡啶修饰通过立体阻碍效应增强核酸酶抗性；② C4′连接策略优于传统2′/5′位修饰，能平衡稳定性和RISC兼容性；③ 双胆固醇修饰实现无载体高效递送。这种"一石三鸟"的设计为临床级siRNA药物开发提供了普适性方案，特别适用于需要长期基因沉默的慢性病治疗。