甲醇代谢工程改造毕赤酵母作为工业底盘实现多巴胺生物合成

研究人员针对甲醇作为可再生单碳(C1)原料的工业化应用瓶颈，通过系统代谢工程改造毕赤酵母(P. pastoris)，强化莽草酸途径(shikimate pathway)、敲除降解酶PAS_chr1-4_0441、优化NADH再生与甲醇同化，最终在15 L发酵罐获得12.2 g/L多巴胺产量，为C1原料合成神经活性物质奠定技术基础。

　　

随着全球能源需求激增和环境压力加剧，甲醇因其可再生、碳中性及非粮竞争特性，成为绿色生物制造的理想单碳(C1)原料。然而，甲醇代谢网络的复杂性和甲醛毒性制约了其工业化应用。甲基酵母毕赤酵母(P. pastoris)虽具有GRAS（公认安全）认证和高密度发酵优势，但现有研究对其合成高附加值神经活性物质的效率仍不理想。多巴胺作为治疗临床休克的关键药物及多种高价值化合物的前体，其微生物合成主要依赖传统糖基原料，尚未实现甲醇的高效转化。

针对这一挑战，中国的研究团队在《Bioresource Technology》发表研究，通过系统改造毕赤酵母代谢网络，首次实现甲醇高效合成多巴胺。研究采用四大关键技术：1) 异源表达高活性酪氨酸羟化酶(CYP76AD1/5)和L-多巴脱羧酶(DODC)；2) CRISPR-Cas9介导的降解酶PAS_chr1-4_0441敲除；3) 强化NADH再生系统；4) 15 L发酵罐工艺优化（重点控制pH抑制多巴胺自氧化）。

【De novo biosynthesis of dopamine in P. pastoris】
研究首先对比三种酪氨酸羟化酶（哺乳动物TyrH、植物CYP76AD1/5），发现来自甜菜(B. vulgaris)的CYP76AD5活性最高。通过密码子优化和AOX1启动子驱动表达，结合莽草酸途径限速酶ARO4^K221L过表达，使摇瓶产量达579 mg/L。

【Blocking dopamine degradation pathways】
转录组分析鉴定出多巴胺降解关键酶PAS_chr1-4_0441（推测为单胺氧化酶类似物），敲除后产物损失减少37%。

【Enhancing cofactor supply and methanol assimilation】
过表达甲酸脱氢酶(FDH)和甲醛同化途径基因DAS2（二羟丙酮合成酶），使NADH/NAD⁺比值提升2.1倍，甲醇消耗速率提高68%，摇瓶产量提升至1533 mg/L。

【Fermentation process optimization】
在15 L发酵罐中采用两阶段pH控制策略（生长期pH 5.0，诱导期pH 3.5），有效抑制多巴胺醌的形成，最终产量达12.2 g/L，较初始菌株提高84.2倍。

该研究不仅创下甲醇基多巴胺合成的最高记录，更重要意义在于：1) 证实毕赤酵母作为C1生物制造工业底盘的潜力；2) 建立神经活性物质从C1原料合成的技术范式；3) 为多巴胺衍生物（如去甲乌药碱、羟基酪醇）的生物合成提供通用策略。作者Dexun Fan等指出，未来可通过动态调控系统进一步平衡甲醇代谢流与产物合成，推动甲醇生物制造向更多高值化学品领域拓展。