代谢通路优化与萜烯合酶工程协同提升桑黄菌(-)-aristolone产量的创新策略

本研究针对(-)-aristolone（一种具有抗糖尿病和血管舒张活性的倍半萜）传统生产方式效率低下的问题，通过代谢通路优化与萜烯合酶工程改造桑黄菌（Sanghuangporus sanghuang），实现了产量突破性提升。研究人员过表达法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）增加前体供应，沉默角鲨烯合成酶（SQS）阻断竞争通路，并发现含DQxxD非经典基序的TPS2152酶，通过将其改造为DDxxD植物型基序使催化效率提升2.57倍。最终构建的工程菌株△SQS/TPS2152D+使(-)-aristolone产量达1.33 mg/g，较基础菌株提高217%。该研究为高价值萜类生物合成提供了真菌底盘细胞新范式。

　　

在天然药物开发领域，(-)-aristolone作为一种具有抗糖尿病和血管舒张活性的倍半萜化合物，其传统植物提取和化学合成方法长期面临产量低、成本高的瓶颈。陕西师范大学马小魁团队创新性地选择药用真菌桑黄（Sanghuangporus sanghuang）作为微生物底盘，通过多维度代谢工程策略实现了该化合物的高效生物合成，相关成果发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。

研究团队首先通过基因组挖掘发现桑黄含有9个倍半萜合酶（sesquiterpene synthases, STS），其中TPS2152因携带罕见的DQxxD金属结合基序（区别于典型DDxxD基序）引起关注。为突破前体供应限制，过表达法尼基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS）使FPP前体水平提升，工程菌FPPS+的角鲨烯含量增加78.8%至1.18 mg/g，并首次实现(-)-aristolone的从头合成（0.42 mg/g）。进一步通过RNA干扰沉默角鲨烯合成酶（squalene synthase, SQS）并共表达TPS2152，使△SQS/TPS2152+菌株的(-)-aristolone产量提升210%至1.30 mg/g，同时角鲨烯降低56.8%。

关键技术创新点在于对TPS2152的理性改造：分子对接显示DQxxD→DDxxD突变（TPS2152D）保持底物结合能力（对接得分-9.1 kcal/mol），但催化效率提升2.57倍。整合优化的△SQS/TPS2152D+菌株最终使(-)-aristolone产量达1.33 mg/g。发酵动力学显示产物从第5天开始积累，第8天达到最大比生产率（Q_p），第9天完全抑制角鲨烯合成。

主要技术方法包括：①桑黄原生质体转化系统构建；②FPPS过表达与SQS干扰的双通路调控；③基于重叠PCR的DQxxD基序定点突变；④GC-MS和HPLC联用的萜类产物分析；⑤AutoDock Vina分子对接指导酶改造。

研究结果可分为四个关键发现：

1. 桑黄萜烯合酶的特征解析：基因组分析揭示TPS2152含非典型DQxxD基序，其三维结构模拟显示该变异可能影响Mg²⁺结合和底物取向。
   

   

2. 前体供应通路的优化：FPPS过表达使MVA（甲羟戊酸）途径关键基因表达上调2.8-3.9倍，FPP通量增加驱动(-)-aristolone的首次合成。

3. 代谢分流调控效应：SQS沉默使FPP从三萜途径转向倍半萜合成，△SQS/TPS2152+的(-)-aristolone产量较FPPS+提升210%，且不影响菌体生长（p>0.05）。
   

   

4. 酶工程突破：TPS2152D的K_m值保持108.95 μM同时，V_max提升至57.80 nmol/min/mg，证实DDxxD基序可优化催化周转率。

该研究的突破性意义体现在三方面：
① 技术层面：首次实现真菌DQxxD基序的理性改造，为萜烯合酶工程提供新靶点；
② 产业层面：建立产量达毫克级的桑黄微生物工厂，解决(-)-aristolone供给难题；
③ 科学层面：揭示真菌与植物TPS的进化分歧，证实基序变异可调控催化效率而不影响底物特异性。

这项研究不仅为高价值萜类生物制造提供了可推广的技术范式（如"前体供应+竞争通路阻断+酶改造"的三联策略），更开创性地证明药用真菌可通过合成生物学改造替代传统植物提取，对天然药物开发具有里程碑意义。未来研究可进一步探索TPS215D在其他萜类合成中的应用，以及桑黄底盘在复杂氧化倍半萜生产中的潜力。