细胞周期调控塑造芽殖酵母复制起点的双六聚体加载机制

本研究揭示了芽殖酵母中MCM双六聚体(DH)加载的分子机制，发现Orc2亚基内在无序区(IDR)通过形成MCM-ORC(MO)中间体促进复制起始，而CDK磷酸化该区域可阻断MO形成。研究团队通过冷冻电镜和生化实验证明，含双高亲和力ORC结合位点的复制起点可绕过CDK调控，为理解真核生物复制起始的进化约束和调控可塑性提供了新视角。

　　

在真核生物中，基因组复制起始受到严格调控以确保每个细胞周期仅复制一次。这一过程的核心是在G₁期将MCM解旋酶以头对头的双六聚体(DH)形式装载到复制起点上。然而，关于MCM加载的具体机制和细胞周期依赖性激酶(CDK)如何精确调控这一过程仍存在重要知识空白。芽殖酵母的复制起点通常包含一个高亲和力的ORC结合位点(A/B1)和一个低亲和力位点(B2)，但不同起点间ORC结合位点的空间排布和亲和力差异暗示可能存在多样化的加载机制。

Francis Crick研究所等机构的研究人员通过整合结构生物学和功能分析，揭示了MCM加载的分子机制及其调控原理。研究发现Orc2亚基的N端内在无序区(IDR)通过形成MCM-ORC(MO)中间体来稳定ORC在低亲和力位点的结合，而CDK对该区域的磷酸化可特异性阻断MO形成。值得注意的是，含有双高亲和力ORC结合位点的合成起点能绕过CDK抑制，这为理解复制起点的进化选择压力提供了新视角。相关成果发表在《Nature Structural & Molecular Biology》上。

研究主要采用冷冻电镜解析了MCM单六聚体(SH)和双六聚体(DH)的三维结构，结合体外重建实验分析了不同ORC突变体的功能。通过DNA结合实验和单分子成像技术，团队比较了野生型和突变型ORC的活性差异。此外，利用芽殖酵母遗传系统验证了合成复制起点在体内的复制特性。

MO是ARS1起点MCM加载的关键中间体
通过AlphaFold2预测和冷冻电镜验证，发现Orc2 IDR(190-231位氨基酸)位于MO界面的核心区域。删除该区域(Orc2ΔN)的ORC虽能正常招募MCM，但MO形成和DH组装效率显著降低，证明MO是常规复制起点DH组装的重要中间体。

MO通过稳定ORC在弱结合位点的结合促进DH组装
对酵母复制起点的分析显示，约三分之一的起点像ARS1一样含有重叠的ORC结合位点。实验证明当起点含有两个高亲和力ORC位点时(即使相距300bp)，Orc2ΔN仍能高效加载DH，而将一个位点替换为低亲和力的B2序列后则需依赖MO。这表明MO的主要功能是稳定ORC在弱结合位点的结合。

CDK磷酸化Orc2特异性阻断MO形成
CDK磷酸化Orc2的ORC(Orc6-4A突变体)在ATPγS中能正常招募MCM，但无法形成MO或DH。冷冻电镜结构显示磷酸化ORC加载的SH具有完全闭合的Mcm2-5"门"结构，说明CDK抑制发生在环闭合后的MO形成步骤。值得注意的是，双高亲和力位点起点能抵抗CDK抑制，在体外复制实验和体内复制系统中均保持活性。

MO非依赖的DH组装机制
盐稳定性实验显示SH半衰期约3.5分钟，显著短于DH。通过可诱导的lacO阻遏系统证明，两个独立加载的SH可通过一维扩散相遇形成DH，且这一过程不需要游离MCM-Cdt1或Cdc6参与。模拟计算表明DH形成效率随ORC位点间距增大而降低，但与DNA螺旋旋转同步的扩散模式确保相遇时保持正确取向。

该研究系统阐明了真核生物复制起始的两种并行机制：MO依赖的路径需要Orc2 IDR介导的ORC再捕获，而MO非依赖路径则通过独立加载的SH扩散组装。从进化角度看，现代酵母起点多采用不对称的ORC结合位点布局，可能与CDK调控的约束有关——含双高亲和力位点的起点虽更高效但会逃逸细胞周期监控。这些发现为理解从古菌到高等真核生物的复制起始机制演变提供了重要线索，也为探索癌症等疾病中复制调控异常提供了新视角。