CRISPR/Cas9筛选揭示内体-高尔基体界面蛋白调控反义寡核苷酸活性的新机制

本研究通过CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选结合遗传剪接报告系统，系统鉴定了调控反义寡核苷酸(ASO)活性的关键基因网络。研究人员发现AP1M1和TBC1D23等内体-高尔基体运输相关蛋白通过延迟内体成熟显著增强ASO的核质转运效率，为改善核酸药物递送效率提供了新靶点。该成果发表于《Nature Communications》，为优化ASO治疗策略提供了重要理论依据。

　　

在核酸药物研发领域，反义寡核苷酸(ASO)因其能精确调控基因表达而备受关注。然而这些经过化学修饰的单链DNA分子面临着一个关键瓶颈——超过98%的ASO会被困在内体系统中，最终被运送到溶酶体降解。这种低效的内体逃逸(endosomal escape)现象严重限制了ASO的治疗效果，但调控这一过程的分子机制长期以来不甚明确。

为破解这一难题，来自罗氏和基因泰克的研究团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究。他们创新性地将CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选与新型EGFP剪接报告系统相结合，系统鉴定了调控ASO活性的关键基因网络。研究发现内体-高尔基体界面的运输蛋白AP1M1和TBC1D23能通过调控内体成熟速度显著影响ASO的核质转运效率，这为改善核酸药物递送效率提供了全新视角。

研究主要采用了以下关键技术：1)构建EGFP剪接报告系统实时监测ASO活性；2)全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选结合双轮流式分选富集；3)阵列式CRISPR验证筛选结合高内涵成像；4)建立AP1M1和TBC1D23基因敲除细胞系进行功能验证；5)利用DQ-red BSA示踪技术分析内体-溶酶体运输动力学；6)开发转基因小鼠模型进行体内验证。

CRISPR/Cas9筛选揭示内体-高尔基体界面蛋白调控ASO活性
研究人员首先开发了基于β-珠蛋白内含子的EGFP剪接报告系统，通过FACS分选GFP阳性和阴性群体，结合两轮CRISPR筛选，获得了迄今最全面的ASO活性调控基因图谱。基因本体分析显示，显著富集的基因主要参与内体运输、高尔基体功能和网格蛋白适配体活性等过程。

阵列式CRISPR验证筛选确认关键调控因子
通过98个基因的阵列式验证，研究人员发现AP1复合物(特别是AP1M1亚基)和TBC1D23是调控ASO活性的最强候选因子。这些蛋白均参与内体与高尔基体之间的逆向运输过程，提示内体-高尔基体界面是决定ASO命运的关键枢纽。

AP1M1和TBC1D23是ASO活性的关键调控因子
在HEK293和U2OS细胞中构建的AP1M1敲除系显示ASO活性显著增强，而TBC1D23敲除则产生相反效果。时间进程实验表明，AP1M1缺失使ASO的基因沉默效应提前24小时出现，暗示内体运输过程被显著改变。

AP1M1调控机制位于gymnotic摄取之后
转录组分析排除了AP1M1影响ASO摄取的假说。当ASO通过脂质体转染绕过内体途径时，AP1M1的调控作用消失，证实其特异作用于内体运输过程而非摄取阶段。

溶酶体功能在AP1M1敲除细胞中保持正常
通过多种溶酶体探针(Magic Red、Cytofix Lyso等)和galectin-3检测，研究人员证实AP1M1缺失不会导致溶酶体膜通透性增加或功能损伤，排除了ASO从破损溶酶体泄漏的可能性。

AP1M1缺失扰乱高尔基体网络并延迟内体运输
免疫荧光显示AP1M1敲除细胞中TGN46蛋白水平降低且分布异常。DQ-red BSA示踪实验证实，AP1M1缺失使内体货物向溶酶体的转运延迟约5小时，这种运输阻滞可能为ASO逃逸创造了时间窗口。

Ap1m1表达调控ASO体内活性
在转基因小鼠模型中，肝脏特异性敲低Ap1m1可显著增强ASO的剪接校正活性，成功将体外发现转化到体内系统，证实了这一调控通路的生理相关性。

这项研究通过系统性筛选首次揭示了内体-高尔基体运输网络在调控ASO活性中的核心作用。特别重要的是，发现AP1M1缺失通过延缓内体成熟而不破坏溶酶体功能的方式促进ASO逃逸，这为开发新型核酸药物递送策略提供了独特思路。研究提出的"运输延迟促进逃逸"模型不仅适用于ASO，也可能拓展到mRNA疫苗等其它核酸药物的递送优化。该成果为克服核酸药物递送这一关键瓶颈提供了多个可干预的分子靶点，具有重要的转化医学价值。