外泌纳米颗粒蛋白冠指纹图谱揭示胞吐途径的时间依赖性机制

研究人员针对纳米载体(NCs)胞吐机制不清的问题，通过分析人结肠癌细胞HCT 116中外泌磁性葡聚糖包被氧化铁颗粒(mgDex)的蛋白冠(EXO-PC)，结合质谱蛋白质组学和生物信息学分析，发现外泌颗粒表面蛋白冠可作为胞吐途径的分子指纹。研究表明，预形成的人血浆蛋白冠对胞吐程度和途径影响有限，而时间依赖性非经典胞吐机制（以溶酶体胞吐为主伴随细胞外囊泡分泌）的发现，为纳米载体的精准设计和生物医学应用提供了新见解。

　　

在纳米生物相互作用领域，纳米载体(NCs)的细胞摄取机制已被广泛研究，但其离开细胞的详细机制——胞吐过程及其驱动因素仍知之甚少。这一知识缺口严重制约了纳米载体在诊疗应用中的精准设计。例如，诊断用纳米载体需延长细胞内滞留时间，而高负载导致的细胞毒性又需促进其外排。这种矛盾凸显了揭示胞吐机制的重要性。

德国美因茨大学医学中心的研究团队创新性地提出：外泌纳米载体表面的蛋白冠(EXO-PC)可作为其胞吐途径的分子指纹。通过对人结肠癌细胞HCT 116模型中外泌磁性葡聚糖包被氧化铁颗粒(mgDex)的时序分析，结合质谱蛋白质组学(LC-MS)和透射电镜(TEM)等多技术联用，首次揭示了纳米载体胞吐途径的动态演变规律。相关成果发表在《Acta Biomaterialia》上。

研究采用的核心技术包括：1）动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征mgDex理化性质；2）电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)和流式细胞术定量胞吐动力学；3）基于LC-MS的蛋白质组学结合DAVID生物信息学分析EXO-PC组成；4）高分辨率电镜技术追踪纳米载体亚细胞定位。

3.1 实验设计与纳米载体特性
研究设计了三重目标：预形成蛋白冠(PC)的影响、胞吐时序特征及途径解析。mgDex以磁铁矿(Fe₃O₄)为核心，葡聚糖(Dex)为壳层，平均尺寸123±30 nm（TEM测定）。多角度光散射(MALS)显示其流体力学直径为143 nm，zeta电位-5.9 mV，具有典型的簇状形态特征。

3.3 蛋白冠依赖性胞吐分析
预形成的人血浆PC以血清白蛋白(>50%)为主，但未显著改变mgDex的摄取效率。ICP-OES检测发现，无论是否预涂PC，胞吐均在2小时达峰值（胞内铁含量最低），随后因颗粒再摄取而回升。这种动力学在24小时周期内呈现U型曲线，表明细胞具有主动回收外泌颗粒的能力。

3.4 蛋白质组学解析EXO-PC
通过DAVID工具将EXO-PC蛋白注释至五个关键细胞区室：细胞外囊泡、线粒体、膜区域、溶酶体和内体。2小时胞吐时，细胞外囊泡相关蛋白（如HSP90、组蛋白H2A/J）占比高达56.8%，6小时时骤降至23.4%，至24小时又恢复至初始水平。这种振荡模式提示不同时间节点主导的胞吐途径存在显著差异。

3.5 超微结构验证
TEM显示2小时胞吐时mgDex定位于具有多泡体(MVB)和溶酶体特征的杂交区室。这些区室分泌后，其内容物（如50-60 nm的腔内囊泡(ILVs)）降解释放的蛋白被吸附至mgDex表面。6小时时，mgDex转移至自噬相关多层膜结构；24小时则见于大型自噬溶酶体，伴随线粒体成分的显著富集。

这项研究开创性地建立了外泌纳米载体蛋白冠的指纹图谱分析方法，证明溶酶体胞吐是mgDex的主要外排途径，且该过程与细胞外囊泡分泌密切偶联。时间分辨分析揭示：肿瘤细胞通过动态调整胞吐机制应对纳米载体压力——早期（2小时）以溶酶体-MVB杂交途径为主，中期（6小时）转向自噬相关途径，后期（24小时）部分恢复初始模式。

该发现对纳米医学具有双重意义：一方面为延长诊疗纳米载体胞内滞留提供了新靶点（如抑制溶酶体胞吐）；另一方面揭示了通过表面工程（如特定蛋白冠预涂）定向调控胞吐途径的可能性。特别是鉴定出的损伤相关分子模式(DAMPs)如HSP90，提示外泌纳米载体可能携带免疫调控信号，为肿瘤疫苗设计开辟了新思路。

研究也存在一定局限：仅针对特定肿瘤细胞系和纳米载体类型，未来需拓展至更多模型。作者建议下一步研究单蛋白预涂对胞吐的精确调控，以及通过工程化蛋白冠实现纳米载体的定向器官分布。这些突破将推动纳米载体在跨屏障递送（如血脑屏障穿透）等临床挑战中的应用。