HRI激酶通过HDX-MS揭示血红素结合变构抑制的结构机制及其在癌症和神经退行性疾病中的治疗潜力

本研究针对HRI激酶（Heme-regulated inhibitor kinase）在应激反应和疾病中的调控机制，通过氢氘交换质谱（HDX-MS）和AlphaFold 3建模，揭示了血红素类似物hemin与ATP竞争性抑制剂（如dabrafenib）的差异化抑制模式，为开发靶向HRI的变构药物提供了结构基础，对癌症和神经退行性疾病的治疗策略具有重要指导意义。

　　

在细胞应对压力时，蛋白质翻译的精确调控至关重要。HRI激酶（Heme-regulated inhibitor kinase）作为真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化调控者，既是红细胞中血红素（heme）的传感器，又在癌症和神经退行性疾病中扮演关键角色。然而，HRI如何通过血红素结合实现变构抑制？其与ATP竞争性抑制剂的机制差异何在？这些问题长期困扰着领域内的研究者。尤其令人困惑的是，尽管HRI的小分子激活剂（如BTdCPU）在细胞中表现活跃，但其体外作用机制始终未能阐明。

为了回答这些问题，国内某研究机构的研究人员开展了一项综合性研究，结合氢氘交换质谱（HDX-MS）、生物化学和生物物理学手段，首次揭示了HRI的双重抑制机制。研究发现，血红素类似物hemin通过诱导HRI大规模结构重排（包括无序区段的折叠）实现变构抑制，而ATP竞争性抑制剂（如dabrafenib）仅局部作用于激酶域。这一发现为开发靶向HRI的变构药物提供了新思路，相关成果发表在《Biochemical Journal》上。

研究团队运用了多项关键技术：1）重组人HRI蛋白的纯化与去磷酸化处理；2）磷酸化位点质谱鉴定；3）ADP-GLO激酶活性检测；4）纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）分析蛋白稳定性；5）基于AlphaFold 3的HRI二聚体结构预测；6）HDX-MS解析抑制剂结合后的构象变化。

HRI寡聚化状态与磷酸化无关
通过凝胶过滤和质谱光散射分析，研究者发现HRI以二聚体形式存在（约150 kDa），且磷酸化状态不影响其寡聚化。AlphaFold 3预测模型显示，HRI激酶域呈"背对背"排列，与已知的eIF2α激酶家族（如PKR和GCN2）构象一致。

HRI在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点广泛自磷酸化
质谱鉴定出41个自磷酸化位点，包括激活环关键位点T486/T488（小鼠同源位点T483/T485）。意外发现多个磷酸酪氨酸位点（如Y192/Y193），提示HRI可能具有双特异性激酶特征。

RAF抑制剂和GCN2iB可抑制HRI
活性实验显示，BRAF^V600E抑制剂dabrafenib（IC₅₀ 930 nM）和encorafenib（IC₅₀ 1070 nM）以及GCN2工具化合物GCN2iB（IC₅₀ 620 nM）均能抑制HRI，而小分子激活剂BTdCPU在体外未显示直接激活作用。nanoDSF表明抑制剂结合显著提高HRI热稳定性（ΔT_m最高达+9.1°C）。

Hemin与dabrafenib的抑制机制差异
HDX-MS揭示hemin结合引发全蛋白范围的构象变化：
1）血红素结合域（113-127区段，含H119/H120）溶剂暴露减少；
2）N端无序区（1-70）和激酶插入区（230-370）出现EX1动力学特征，提示折叠事件；
3）激酶域激活环（461-463）保护性增强。
相比之下，dabrafenib仅局部影响激酶域（如P环、DFG基序），但意外增加C-lobe（531-559）的溶剂暴露。

这项研究不仅阐明了HRI的双重抑制机制，更揭示了其结构动态调控的独特性。hemin诱导的全局构象变化暗示变构抑制可能通过限制激酶域构象灵活性实现，而ATP竞争性抑制剂则直接阻断催化活性。尤其值得注意的是，HRI在酪氨酸位点的自磷酸化能力为其功能调控增添了新维度，可能影响其底物特异性。

在疾病治疗方面，研究证实临床批准的RAF抑制剂可交叉抑制HRI，为药物重定位提供可能。同时，hemin与ATP竞争性抑制剂的机制差异提示：针对HRI变构位点的药物设计或能避免传统激酶抑制剂的耐药性问题。尽管BTdCPU的体外无效性暗示其细胞活性可能通过线粒体解偶联间接实现（与近期Perea等的研究一致），但HRI作为癌症和神经退行性疾病的靶点价值已得到进一步确证。

这项工作的突破性在于首次将HRI的变构抑制与具体结构变化相关联，为理解eIF2α激酶家族的调控多样性树立了新范式。未来研究可基于HDX-MS揭示的动态区域，开发选择性更强的HRI变构调节剂，推动其在应激相关疾病治疗中的应用。