基于高亲和力抗体组合的降钙素原(PCT)荧光微球免疫层析检测新方法及其临床应用研究

本研究针对降钙素原(PCT)检测中抗体筛选效率低、传统方法灵敏度不足等问题，开发了基于时间分辨荧光微球(TRFM)的新型免疫层析检测技术(FM-ICS)。通过真核表达系统获得全长PCT蛋白，筛选出15株高亲和力IgG1单抗，结合CDR区分析和抗原表位预测，最终确立MomAb-8/MomAb-20最佳抗体对。临床验证显示该方法检测限达1.5 ng/mL，与罗氏平台相关性达0.9828，为感染监测和抗生素使用指导提供了高效工具。

　　

微生物感染和抗生素耐药性一直是全球发病率和死亡率居高不下的重要原因。近年来，降钙素原(procalcitonin, PCT)作为微生物感染和脓毒症的特异性生物标志物日益受到重视，其在感染早期诊断和抗生素疗效监测中展现出独特价值。然而，现有PCT检测技术面临核心抗体筛选效率低下、传统方法灵敏度不足等瓶颈问题，特别是在复杂病原微生物共存和耐药菌株涌现的新形势下，开发高效检测方法显得尤为迫切。

针对这一科学问题，苏州生物医学工程技术研究所等机构的研究人员开展了一项创新性研究，成果发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》。研究团队首先采用真核表达系统成功制备了全长PCT重组蛋白，通过传统细胞融合技术获得83个阳性杂交瘤克隆，从中筛选出15株高亲和力IgG₁亚型单抗。借助互补决定区(complementarity-determining region, CDR)分析和抗原表位预测，结合胶体金免疫层析(colloidal gold-based immunochromatographic assay, ICA)验证，最终开发出基于时间分辨荧光微球(time-resolved fluorescent microsphere, TRFM)的新型免疫层析检测技术(fluorescent microsphere-based immunochromatographic strip, FM-ICS)。

关键技术方法包括：1) HEK293F细胞真核表达系统制备重组PCT-His融合蛋白；2) 电融合技术构建杂交瘤细胞并筛选高亲和力单抗；3) 竞争ELISA(competitive ELISA, cELISA)评估抗体亲和力；4) 抗体可变区序列分析和三维结构建模；5) 临床样本验证FM-ICS性能。

3.1 真核系统表达rPCT蛋白
研究通过基因编辑将PCT-His基因整合至慢病毒载体，在HEK293F细胞中稳定表达。SDS-PAGE显示13 kDa目标条带，商业ELISA验证显示蛋白具有良好反应性，为后续免疫实验奠定基础。

3.2 高亲和力抗rPCT杂交瘤筛选
采用阶梯式免疫策略后，通过电融合获得783个杂交瘤细胞，其中117个识别rPCT蛋白。竞争ELISA证实15株单抗具有高亲和力，包括MomAb-8、-9、-18和-20，其50%抑制浓度显著低于对照组。

3.3 基于结构分析的抗体配对测试
抗体可变区测序显示重链可变区同源性58.22%，轻链87.38%。分子对接预测显示多数抗体结合表位位于PCT C端。胶体金ICA验证发现MomAb-8/MomAb-20组合反应性最强，而空间位阻导致MomAb-9与MomAb-14/-16无法有效配对。

3.4 FM-ICS方法学性能评估
最优抗体对构建的FM-ICS检测限达1.5 ng/mL，线性范围1.5-100 ng/mL。临床样本测试显示弱阳性重复性7.093%，强阳性8.54%。与罗氏平台比较，136例样本相关系数R²=0.9828，回归方程y=0.9687x+0.1892，证实其临床适用性。

这项研究创新性地将传统抗体工程与现代生物信息学分析相结合，建立了从抗体筛选到检测方法开发的高效路径。特别值得注意的是，研究发现抗体绝对亲和力并非ICA效能的唯一决定因素，抗体-抗原解离速率等动态特性可能起关键作用。FM-ICS技术相比传统方法具有操作简便、检测快速（15分钟内完成）、成本低廉等优势，在基层医疗机构感染筛查和抗生素合理使用指导方面具有重要推广价值。

研究也存在一定局限性，如未阐明TRFM共价标记与胶体金非共价标记对检测性能的差异机制。未来研究可进一步拓展至其他炎症标志物的联检技术开发，并探索抗体动力学参数与层析性能的量化关系。该成果为POCT(point-of-care testing)诊断技术发展提供了新思路，对推动感染性疾病精准诊疗具有重要意义。