含3′–5′核酸外切酶结构域的DinG蛋白结构与功能研究揭示其在DNA交联修复中的协同机制

这篇研究首次解析了金黄色葡萄球菌DinG（SaDinG）融合蛋白的晶体结构，揭示其同时具备5′–3′解旋酶和3′–5′核酸外切酶（Exo）活性的分子机制。通过突变分析和表型实验，证实其双酶活性受ATP浓度调控，并特异性参与DNA交联剂（如丝裂霉素C和甲醛）的修复，为细菌基因组维护机制和抗菌靶点开发提供了新见解。

　　

Structural and functional investigation of DinG containing a 3′–5′ exonuclease domain

ABSTRACT
金黄色葡萄球菌DinG（SaDinG）作为SF2解旋酶家族成员，其N端融合的3′–5′核酸外切酶（Exo）结构域的功能机制长期未知。研究通过晶体结构解析（分辨率3.2 ?）和生化实验，首次证实SaDinG具备双酶活性：Exo结构域依赖Mn²⁺/Co²⁺催化ssDNA降解，而解旋酶结构域以5′–3′方向解旋多种DNA底物（包括叉状、泡状和缺口双链）。有趣的是，高浓度ATP会抑制两种活性，暗示体内存在ATP依赖的调控机制。

INTRODUCTION
XPD/DinG解旋酶家族在生命三域中高度保守，但细菌中融合Exo结构域的DinG（如SaDinG）功能未明。与大肠杆菌DinG（EcDinG）不同，SaDinG不受LexA调控，且其Exo结构域与DEDDh家族核酸酶（如EcExoI）同源。结构比对显示，SaDinG的假铁硫簇（pFeS）结构域虽不结合[4Fe-4S]簇，却保留了DNA结合关键残基（K385/K389）。

RESULTS
Domain arrangement and overall structure
SaDinG的晶体结构揭示其五域架构：Exo、MD1、pFeS、Arch和MD2。Exo结构域通过β6–β7发夹连接MD1，其活性中心含D10/E12/D95/H149/D154组成的DEDDh基序，协调两个Ca²⁺离子。MD2结构域中，F804/F823/Y864通过π-π堆叠固定ssDNA，而Arch域的“盖子发夹”（Y539）在DNA结合后构象变化，可能防止底物回退。

Exonuclease activity characterization
Exo活性偏好嘧啶序列（dT>dC>dA>dG），最适盐浓度50 mM。关键突变体D10A和H149A几乎完全丧失活性，而H90A仅产生中间产物，说明H90负责ssDNA导向。值得注意的是，3′端荧光标记会抑制降解，这与Exo结构域的“帽螺旋”空间位阻有关。

Helicase activity regulation
实时荧光解旋实验显示，SaDinG对5′突出端底物活性最强（1 mM ATP时达峰值），而K801A/F804A突变使解旋能力完全丧失。ATP通过降低DNA结合亲和力（Kd值升高）抑制双酶活性，这种“自我刹车”效应可能由生理ATP浓度调控。

Biological role in crosslink repair
SaDinG缺失株对丝裂霉素C（MMC）和甲醛敏感，但补回野生型（而非D10A或ATP酶缺陷突变体）可恢复抗性。这支持了其通过5′–3′解旋与3′–5′降解协同处理交联DNA的模型：解旋酶域推进时，Exo域同步切除损伤链，为下游修复提供中间体。

DISCUSSION
与枯草芽孢杆菌MrfAB系统相比，SaDinG将双酶功能整合为单一多肽，但解旋方向相反（5′–3′ vs 3′–5′）。其pFeS结构域虽失去氧化还原传感功能，仍通过K385/K389维持DNA结合。ATP依赖性抑制现象与抗噬菌体蛋白GajAB类似，或反映细菌在代谢应激下的酶活性调控策略。该研究为靶向DNA修复网络的抗菌设计提供了新思路。