新型蝙蝠流感病毒载体MERS疫苗单次鼻内免疫可有效抵御致死性MERS-CoV攻击

本研究开发了一种基于蝙蝠流感病毒(IAV)载体的中东呼吸综合征(MERS)疫苗Len_S1，通过鼻内接种可诱导黏膜、体液和细胞免疫三重应答，单次免疫即可保护hDPP4转基因小鼠抵御致死性MERS-CoV攻击，双次免疫更能完全阻断病毒复制。该疫苗采用流感D病毒(IDV)HEF蛋白替代传统HA/NA，显著提升抗原递送容量，其温度敏感型(ts)、冷适应(ca)和减毒(att)特性确保安全性，血清抗体可交叉中和A/B/C三系MERS-CoV毒株，为防控人畜共患病提供创新解决方案。

　　

ABSTRACT
中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)作为持续在单峰骆驼中进化的高致死率人畜共患病病原体，目前尚无商用疫苗。研究团队创新性地构建了基于蝙蝠流感A病毒(IAV)的疫苗载体，通过替换血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)开放阅读框为流感D病毒(IDV)的HEF基因，成功开发出表达MERS-CoV刺突S1亚基的温度敏感型减毒疫苗Len_S1。该疫苗在hDPP4转基因小鼠中展现出卓越的保护效力，单次鼻内免疫即可抵御致死剂量攻击，双次免疫更能完全阻断病毒复制与肺损伤。

INTRODUCTION
自2012年发现至今，MERS-CoV已在27国导致2,613例实验室确诊病例，死亡率高达36%。尽管其传播力不及SARS-CoV-2，但病毒在骆驼群体中的持续进化及跨种传播风险不容忽视。现有肌肉注射疫苗难以诱导黏膜免疫，而传统流感载体疫苗存在基因容量有限和与流行株重配的风险。蝙蝠流感病毒因不与常规IAV重配、宿主范围受限等特性，成为理想疫苗载体候选。

RESULTS

疫苗载体构建与优化
研究团队将IDV的HEF基因与蝙蝠流感H17N10的HA/NA包装信号重组，构建出七节段基础载体。通过切换包装信号策略，当S1基因由HA包装信号(H17ps)驱动时，其在MDCK细胞中的表达量较NA包装信号(N10ps)版本显著提升3倍，且不影响病毒复制能力。Western blot和免疫荧光证实S1蛋白稳定表达且定位于细胞质。

减毒策略实现
采用双路径减毒方案：① NS1蛋白截短至128个氨基酸(NS128_S1)；② 引入列宁格勒H2N2株的PB2-V478L、PB1-K265N/V591I和NEP-M100I突变。后者获得的Len_S1表现出典型ts/ca/att特征：39°C时复制效率降低100倍，37°C形成的噬斑直径缩小60%，且温度升高显著抑制S1表达。小鼠实验证实Len_S1仅在上呼吸道短暂复制，而亲本株H17ps_S1可扩散至肝脏。

免疫保护效能
在hDPP4转基因小鼠模型中，单剂Len_S1诱导的血清中和抗体(NAb)效价达1:80，鼻洗液IgA水平升高8倍，ELISPOT显示脾细胞针对S1抗原的IFN-γ分泌增加15倍。攻毒实验显示：

• 单次免疫组：100%存活率，肺组织病毒载量降低99%
• 双次免疫组：完全检测不到呼吸道病毒复制
  组织病理学显示，双免组肺泡炎症和支气管上皮坏死完全消失，而对照组出现典型间质性肺炎病变。

交叉保护潜力
血清PRNT₉₀实验证实，Len_S1免疫血清对A系(EMC)、B系(AH13)和C系(NV1657)毒株的中和效价分别达1:320、1:80和1:160，表明其广谱保护潜力。值得注意的是，非中和性抗体可能通过Fc介导的效应功能增强保护，这解释了为何低NAb效价仍能提供完全保护。

DISCUSSION
相较于腺病毒或痘苗病毒载体，蝙蝠流感载体具有三大优势：① 无预存免疫干扰；② HEF置换策略使外源基因容量提升至1.8kb；③ 严格的宿主限制性确保生物安全性。研究还发现，列宁格勒株减毒位点对蝙蝠流感病毒同样有效，这为其他蝙蝠载体疫苗开发提供新思路。未来需在骆驼等自然宿主中验证该疫苗效果，并探索与佐剂灭活疫苗的联合免疫策略。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：使用反向遗传学系统拯救重组病毒，TCID₅₀法测定病毒滴度，rVSV-eGFP-S假病毒中和试验，以及基于K18-hDPP4转基因小鼠的攻毒模型。所有动物实验均在BSL-3实验室完成，组织病理采用Romulen red显色系统检测MERS-CoV核蛋白(N)抗原。统计采用GraphPad Prism 10进行ANOVA多重比较。