低活性氧水平抗生素持久菌通过非ROS依赖性膜破坏机制被清除

这篇研究揭示了细菌持久性（persistence）和耐受性（tolerance）的核心机制——通过抑制活性氧（ROS）积累实现抗生素抵抗，并提出创新性解决方案：氨基糖苷类-多黏菌素协同作用通过非ROS依赖的膜破坏途径高效清除持久菌。研究明确了环境胁迫（如营养剥夺）诱导表型耐受性（phenotypic tolerance）与突变型持久性（如hipA7/metG2）的差异，为临床攻克耐药菌感染提供了新策略（如针对生物膜和革兰阴性菌的联合疗法），同时规避了传统ROS依赖疗法的局限性。

　　

表型耐受性与营养剥夺的关联

研究首先通过环境模型（如静止期培养或盐水饥饿）探究营养限制对大肠杆菌（E. coli）存活的影响。静止期细胞对环丙沙星（ciprofloxacin）、氨苄青霉素（ampicillin）、卡那霉素（kanamycin）和丝裂霉素C（mitomycin C）等四类抗生素表现出完全存活（100%），符合耐受性定义。而添加新鲜培养基恢复营养后，野生型细胞存活率骤降至0.001%，表明这种保护作用是可逆的表型耐受性。值得注意的是，环丙沙星处理后10%的"亚群存活"实际是移除药物后琼脂板上ROS依赖性死亡的结果——添加抗氧化剂（联吡啶+DMSO）可使存活恢复至100%，提示静止期DNA损伤在修复过程中诱发了致死性ROS爆发。

突变型持久性的独特特征

与表型耐受性不同，hipA7和metG2突变菌株在营养恢复后仍保持高存活率（5%-10%），且不受抗氧化剂影响。这种内源性休眠状态对多种抗生素（包括氟喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和DNA交联剂）均有效，证实其为真正的遗传性持久性。通过ampicillin富集的hipA7持久菌单细胞分析显示，其ROS水平（1.4%阳性细胞）、DNA断裂（RecN-YFP标记仅1%阳性）和翻译活性（RplA-YFP荧光强度低）均显著低于野生型，说明持久菌通过全局代谢抑制逃避抗生素致死机制。

ROS抑制是保护性核心机制

敲除过氧化氢酶基因（ΔkatGE）使静止期野生型细胞对环丙沙星的敏感性提高100倍，而hipA7 ΔkatGE双突变体存活率仍达1%，证实ROS积累是杀死主要种群的关键因素。通过carboxy-H₂DCFDA荧光探针检测发现，营养恢复时ΔkatGE突变体出现异常ROS峰值，可能与DNA损伤-ROS正反馈循环有关。值得注意的是，持久菌即便在营养充足条件下仍能维持低ROS水平，这种特性使其抵抗传统抗生素的ROS依赖性杀伤途径。

氨基糖苷-多黏菌素协同灭菌策略

基于ROS抑制的普遍性，研究转向非ROS依赖的膜破坏策略。临床可达浓度（卡那霉素2.5 MIC+多黏菌素B 3 MIC）的组合能在数小时内将hipA7持久菌存活率从10%降至10^-5%，对野生型持久亚群（0.001%）更是实现完全灭菌（10^-6%）。这种协同作用具有广谱性：

• 对临床分离的E. coli和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）灭菌效果达10^-5%
• 对生物膜模型杀伤效率提高10⁴-10⁵倍
• 对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）也有10倍杀伤增强
  机制研究表明，该组合通过破坏膜电位（DiSC₃(5)荧光增强2-3倍）和增加膜通透性（碘化丙啶100%阳性），且不受ΔkatGE突变或抗氧化剂影响，证实其ROS独立性。

临床转化潜力与局限性

研究特别指出该策略的临床优势：多黏菌素（9 μg/mL）和氨基糖苷类（20 μg/mL）使用浓度低于人体峰值血药浓度，且对人THP-1巨噬细胞无毒性。由于肾毒性主要源于ROS，该ROS非依赖疗法可联用抗氧化剂（如维生素C）减轻副作用。但需注意：

1. 表型耐受菌需更长时间（7天）清除
2. 对S. aureus效果有限（仅10倍杀伤）
3. 超高抗生素浓度（如500 MIC环丙沙星）可能突破hipA7保护机制

这项研究不仅统一了持久性/耐受性的ROS抑制理论，更通过创新性联合疗法为解决临床顽固性感染提供了新思路，尤其对生物膜相关慢性感染和泛耐受突变株（如ptsI缺陷菌）具有重要应用价值。