单纯疱疹病毒1型蛋白激酶Us3底物特异性变化的体外和体内感染影响研究

这篇研究揭示了HSV-1（单纯疱疹病毒1型）蛋白激酶Us3通过激活环（A-loop）中Ala-326残基精细调控多底物磷酸化水平的新机制。研究发现，Us3 Ala-326突变（A326V/A326I）选择性改变gB Thr-887P、UL31等至少14种靶蛋白的磷酸化模式，导致体外细胞间传播效率降低，并在小鼠模型中呈现颅内感染与眼部感染的差异化表型（如A326I显著降低脑部病毒载量，A326V减轻角膜病变）。该研究为理解病毒激酶底物特异性调控与致病性的关联提供了关键线索。

　　

预测结构特征揭示保守调控元件
AlphaFold3结构预测显示，HSV-1 Us3的激活环（A-loop）包含典型DFG和APE基序，其构象灵活性与人类PKA激酶相似。序列比对发现，位于DFG+1位的Ala-326在α疱疹病毒亚科的Simplexvirus、Mardivirus和Varicellovirus属中高度保守，暗示其在激酶功能中的关键作用。

精准突变构建揭示底物特异性调控
通过Red重组技术构建的Us3 Ala-326突变病毒（A326V和A326I）保持激酶整体结构完整性（TM-score>0.5），但显著改变特定底物磷酸化水平：

• A326V使gB Thr-887^P磷酸化水平升高2.1倍，同时增加p167/p144（抗磷酸化AKT抗体检测）的磷酸化；
• A326I则降低gB Thr-887^{P>和p49/p39磷酸化水平，但对Us3自身Ser-147P磷酸化无影响。
  值得注意的是，UL31（p37）的磷酸化在两种突变中均被抑制，而PKA抑制剂实验证实这些变化主要依赖Us3而非宿主激酶。}

体外表型：细胞间传播缺陷
尽管突变病毒在Vero和ARPE-19细胞中的复制动力学与野生型无差异，但斑块面积缩小40%-60%（P<0.001），表明Ala-326通过调控特定底物磷酸化（如UL31）影响病毒细胞间传播效率。

体内感染呈现突变特异性表型
小鼠颅内感染模型显示：

• A326I突变使脑部病毒载量降低10² PFU/g（P<0.05），生存率提高35%；
• A326V在眼部感染模型中表现突出：虽不影响角膜初始复制，但使三叉神经节病毒载量延迟下降（第5天降低80%），并显著减轻角膜基质炎（HSK评分降低2.5倍）和皮肤病变。

机制与转化价值
该研究首次揭示病毒激酶A-loop通过DFG+1位点（Ala-326）实现底物磷酸化精细调控，这种"选择性调控开关"特性为开发靶向Us3的抗疱疹病毒药物提供了新策略。不同氨基酸替换产生差异化表型的现象，提示可通过设计特异性A-loop突变体来定向调控病毒毒力。