铜绿假单胞菌磷脂酶C/鞘磷脂酶PlcH对鞘氨醇磷酸胆碱的降解机制及其在致病性中的新作用

本研究揭示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分泌的双功能磷脂酶C/鞘磷脂酶PlcH可水解宿主信号脂质鞘氨醇磷酸胆碱（SPC），生成鞘氨醇（sphingosine），并通过SphR调控通路激活毒力基因表达。同时，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）α毒素也表现出类似活性，提示SPC可能是细菌磷酸胆碱特异性磷脂酶（PLC）的共性靶点，为病原体干扰宿主鞘脂稳态的机制提供了新视角。

　　

研究内容归纳

ABSTRACT
鞘脂（sphingolipids）是真核细胞膜结构与功能的关键组分，参与宿主感染过程中的多种调控。铜绿假单胞菌作为机会性病原体，分泌具有溶血活性的双功能磷脂酶C/鞘磷脂酶PlcH，通过水解磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine）和鞘磷脂（sphingomyelin）破坏宿主细胞膜，促进炎症反应。本研究首次证实PlcH还能降解信号分子鞘氨醇磷酸胆碱（SPC，又称溶血鞘磷脂），生成鞘氨醇和磷酸胆碱。SPC水解产物通过激活鞘氨醇响应转录因子SphR，进一步调控毒力基因表达。值得注意的是，产气荚膜梭菌α毒素同样可水解SPC，提示SPC可能是磷酸胆碱特异性PLC的广谱底物。

INTRODUCTION
PlcH是铜绿假单胞菌的关键毒力因子，其转录受GbR（响应甘氨酸甜菜碱）、SphR（响应鞘氨醇）和PhoB（响应磷酸盐饥饿）三重调控。传统认为PlcH主要靶向磷脂酰胆碱和鞘磷脂，但其对人工底物对硝基苯磷酸胆碱（NPPC）的水解能力暗示其他含磷酸胆碱的分子也可能是生理相关底物。SPC作为类鞘脂信号分子，可通过激活S1P受体1-5调控细胞增殖、凋亡、免疫应答及内皮屏障功能。

RESULTS

SPC诱导PlcH表达及SphR调控基因转录
实验显示，SPC处理铜绿假单胞菌PA14野生型（WT）4小时后，PlcH活性（以NPPC水解为指标）显著升高，与鞘氨醇和胆碱的诱导效果相当。通过β-半乳糖苷酶报告系统发现，SPC可激活SphR调控的sphA、cerN和sphB启动子，其诱导模式与鞘氨醇及其类似物（如鞘氨烷、植物鞘氨醇）一致，而神经酰胺（ceramide）需经神经酰胺酶CerN代谢后才具诱导活性。

SPC水解依赖plcH并生成鞘氨醇
在ΔplcHR突变株中，SPC对sphA启动子的诱导作用大幅减弱。薄层色谱（TLC）直接证实，WT菌株上清中SPC被水解为鞘氨醇，而ΔplcHR突变株无此活性。值得注意的是，WT中鞘氨醇被迅速代谢（依赖sphBCD基因），而ΔsphBCD突变株可积累鞘氨醇。

产气荚膜梭菌α毒素同样水解SPC
纯化的产气荚膜梭菌α毒素（Cp PLC）预处理SPC后，可恢复ΔplcHR突变株中cerN报告基因的诱导活性。TLC分析显示，Cp PLC能完全转化SPC为鞘氨醇，表明SPC是磷酸胆碱特异性PLC的共性底物。

SphR与GbR在SPC诱导中的作用
在SPC诱导条件下，ΔsphR突变株或SphR结合位点突变株的PlcH活性完全丧失，而ΔgbdR突变株仅在鞘氨醇处理时表现出更高活性。双结合位点突变株（SphR+GbR）对所有诱导物均无响应，证实SPC需水解为鞘氨醇才能通过SphR激活转录。

DISCUSSION
PlcH对SPC的水解拓展了其底物谱，揭示了病原体干扰宿主鞘脂信号网络的新机制。SPC在宿主中的浓度（约50 nM）虽低于实验条件，但其局部（如血小板富集区）可能具有病理意义。未来研究需探索SPC水解对内皮屏障功能的直接影响。

MATERIALS AND METHODS
研究采用铜绿假单胞菌PA14及其突变株，通过报告基因（lacZ）、TLC和酶活检测（NPPC水解）分析SPC代谢。脂质提取采用Bligh-Dyer法，数据统计使用单因素方差分析（ANOVA）及Dunnett事后检验。

ACKNOWLEDGMENTS
感谢美国国立卫生研究院（NIH）及囊性纤维化基金会的资助支持。