腺相关病毒(AAV)制剂开发中稳定性评估的关键分析方法鉴定与预测模型构建

这篇综述系统评估了腺相关病毒(AAV)制剂开发中的分析方法学策略，重点探讨了差示扫描荧光法(DSF)、尺寸排阻色谱-多角度光散射(SEC-MALS)等技术在预测病毒稳定性方面的应用价值。研究创新性地将分析方法分为稳定性指示型（如SEC-UV检测聚集）和预测型（如纳米DSF检测衣壳解折叠），为基因治疗载体的高效制剂开发提供了方法学框架。

　　

粒子尺寸分布分析：DLS、MADLS与SEC-UV的较量
动态光散射(DLS)、多角度DLS(MADLS)和尺寸排阻色谱联用紫外检测(SEC-UV)在AAV-5颗粒分析中展现出不同特性。SEC-UV能精确检测到单体(主峰)、寡聚体和聚集体的三群分布，其灵敏度显著优于仅能识别双峰的DLS。热应力实验(40°C/4周)后，SEC-UV成功捕捉到新增聚集峰，而MADLS因算法抑制低丰度信号导致灵敏度不足。有趣的是，结合温度梯度的DLS检测到F02配方在未应激时即出现散射强度升高，暗示早期寡聚化现象，这为稳定性预测提供了新思路。

衣壳蛋白解折叠：从DSC到纳米DSF的技术进化
差示扫描量热法(DSC)与纳米差示扫描荧光法(NanoDSF)在检测AAV-2衣壳解折叠时获得一致的熔解温度(T_m≈90°C)。但DSC需要350μL样品且通量低，而纳米DSF仅需25μL即可实现高通量检测。冷冻-解冻实验揭示PBS缓冲液的缺陷——DSC检测到T_m显著降低，这与缓冲液组分低温相分离导致的pH偏移相关。值得注意的是，纳米DSF在未应激样本中即能区分不同配方的稳定梯度，其数据与SEC-MALS的长期稳定性结果高度吻合，证实其预测潜力。

基因组释放监测：SYBR Gold染料的独特价值
外源性差示扫描荧光法(eDSF)采用SYBR Gold染料标记DNA，在AAV-2中检测到两个特征性熔解峰：T_m1(55-60°C)对应早期基因组释放，T_m2(62-70°C)反映完全释放。该方法仅需8μL样品即可揭示不同配方对基因组保留能力的差异，其中F06配方表现出最高T_m2值(70°C)，与后续SEC-MALS验证的长期稳定性正相关。这种基因组"泄漏"检测为制剂保护效果评估提供了独特维度。

衣壳定量与基因组负载：HPLC技术的对决
阴离子交换色谱(AEX-HPLC)和SEC-MALS在AAV-2空壳/满壳比率测定中展开竞争。AEX-HPLC基于表面电荷差异分离颗粒，但易受热应力导致的电荷修饰干扰；SEC-MALS则通过联用紫外与光散射检测器，同步获得颗粒尺寸(34nm单体)和基因组负载(3-6%满壳率)。加速老化实验显示，F01配方能保持78.7%满壳率，显著优于PBS参照组的快速降解。分析超离心(AUC)虽能检测部分填充衣壳，但因样品需求量大(400μL)更适合终产品验证。

感染性检测：激光力细胞术的局限性
针对复制缺陷型AAV-2，激光力细胞术(LFC)在感染HEK-293细胞后未能像腺病毒对照组那样产生显著光学力指数变化。这可能与AAV需要辅助病毒才能复制有关，其感染过程不引发足够的细胞骨架重构。相比之下，传统TCID₅₀法虽耗时但更可靠，提示感染性检测仍需功能学实验补充。

方法论启示与转化价值
该研究构建了AAV制剂开发的"分析工具箱"：SEC-UV和温度梯度DLS用于聚集监测，纳米DSF预测衣壳稳定性，eDSF(SYBR Gold)评估基因组保留，SEC-MALS定量产品完整性。这些方法协同克服了传统功能学检测(如报告基因实验)的高成本局限，特别适合早期配方筛选。尤为重要的是，研究发现PBS缓冲液在冻存条件下的不稳定风险，这为基因治疗产品的制剂设计敲响警钟——简单的盐溶液可能危及数亿美元级生物制品的商业可行性。